海藻酸钠固定化微球的制备及性质研究

海藻酸钠固定化微球的制备及性质研究

固定化微生物技术具有良好的生物密度、反应速度快、处理效率高、操作稳定等优点，对环境适应性强、工艺简单等优点，对含油量的处理具有很高的研究价值。实际应用中,载体及包埋条件的选择是固定化微生物在较长时间内保持一定的强度和微生物活性,降低固定化成本并延长固定化微生物使用寿命的关键。海藻酸钠(SA)因具有价格低廉,对细胞相对毒性小,固定化成形方便,传质性能好,对微生物细胞的富集程度高等特点,成为目前废水处理中应用最广的包埋剂之一。活性炭作为一种非极性吸附剂,来源丰富,是目前废水处理中应用最广的吸附剂之一。本实验采用包埋固定化微生物技术处理含油废水,以石油烃降解菌Bbai-1为包埋对象,以SA为包埋载体,活性炭为吸附剂,CaCl2为交联剂,制备海藻酸钠-活性炭固定化微球。考察了海藻酸钠浓度,活性炭含量,交联时间及种子菌液浓度对固定化微球物理性质和原油降解率的影响,确定最佳固定化条件,并考察了固定化微球降解原油的最佳接种量、最适pH和盐度。1材料和方法1.1实验材料1.1.1sparapefici数据实验室保存的石油烃降解菌BrevibacillusparabrevisBbai-1(Gen-BankregistrationnumberisHQ231213),来自于胜利油田含油污水。1.1.2调ph5.4%基准油:用石油醚溶解原油,除沥青和石蜡等,经无水硫酸钠脱水后过滤,滤液用旋转蒸发仪将石油醚蒸出(90℃)。放置一段时间,除去残余石油醚,即得基准油。富集培养基:葡萄糖20g/L,尿素3g/L,KH2PO4·3H2O3g/L,NaCl5g/L,酵母粉1g/L,调pH7~7.5,115℃灭菌15min。无机盐培养基:K2HPO4·3H2O3g/L,NaH2PO43g/L,(NH4)2SO45g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,NaCl5g/L,酵母粉1g/L,调pH7~7.5,121℃灭菌20min。含油培养基:无机盐培养基+0.2%的基准油,121℃灭菌20min。增殖培养基:葡萄糖20g/L,酵母膏3g/L,蛋白胨2g/L,硝酸铵1g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,KCl0.2g/L,调pH7~7.5,115℃灭菌20min。1.2实验方法1.2.1bbai-1的生长曲线测量1.2.1.离心10min取生长对数期的Bbai-1,12000r/min离心10min,无菌水冲洗两次,各离心10min。将得到的菌体用无菌水配制成不同吸光度梯度的菌液,在600nm处测定各自吸光度值(用OD600表示),然后用MPN法测定各自的菌浓。以吸光度为横坐标,菌浓(106cell/mL)为纵坐标,得到Bbai-1的菌浓-吸光度标准曲线:1.2.1.初始菌浓度的确定将吸光度为0.5的Bbai-1种子菌液10mL接入200mL已灭菌的富集培养基中(稀释21倍),通过公式(1)得培养液的初始菌浓为1×106cell/mL。在25℃,pH7,盐度3%条件下,130r/min培养(以不加种子菌液为空白样),开始每隔1小时测定培养液的吸光度,最后每隔0.5小时测定培养液的吸光度,以时间为横坐标,以培养液的吸光度为纵坐标,绘出Bbai-1菌在富集培养基中的生长曲线。1.2.2油含量测定油含量测定方法参照文献进行。1.2.3cacl2种子液的制备配制一定浓度的SA溶液45mL,添加适量活性炭,混匀,121℃灭菌15min,当温度降至30~40℃时,加入5mL处于生长对数期的一定吸光度的种子菌液(稀释10倍),用1mL无菌注射器挤入一定浓度的CaCl2溶液中成形,在4℃冰箱中交联24h,用生理盐水冲洗3遍,4℃冰箱中保存备用。1.2.4关于碳化合物性质的测定1.2.4.菌液的生物过滤取10mL处于生长对数期的Bbai-1菌液,离心,用100mL无菌水配成一定浓度的菌液(稀释10倍),然后加入3g活性炭,在25℃摇床中动态吸附。每隔1小时,取少量菌液过滤。用721分光光度计测OD600(以不加菌液,其他处理方法同上为空白样),根据标准曲线得出菌液的浓度。1.2.4.菌浓中的菌浓计算取2份5mLBbai-1种子菌液离心,分别用50mL无菌水配成一定浓度的菌液,一份以无菌水为空白测定OD600,根据公式(1),得出菌浓c1。另一份加入3g活性炭,于25℃摇床中动态吸附,6h后取菌液过滤测定OD600,得出菌浓c2。忽略吸附前后菌液体积的变化,所以单位质量的活性炭对菌Bbai-1的表面吸附量Γ(cell/g)计算公式为:式(2)中,m为吸附剂的质量(g),V为菌液的体积(mL),c1、c2为吸附前后的菌浓(cell/mL)。1.2.5固定化微球性能的测定1.2.5.1.微球直径的测定将制得的微球置于玻璃板上,用游标卡尺随机测量50粒微球直径(mm),取平均值。1.2.5.玻片色质量mi将制备好的固定化微球取出大小形状相近的15粒,置于天平上。在微球上面放一个载玻片,天平归零,然后慢慢地压载玻片,观察微球直至变形且不能恢复为准,读出微球所能承受的最大质量Mi,然后换算成压力Fi(mN)。单个微球的机械强度(用压力表示)为Fi=10Mi/15,分别测量3组取平均值,即为微球的平均机械强度:1.2.5.微球的渗透红墨水法从制得的固定化微球中选取形态完好、粒径相同的微球,浸入红墨水中,每隔5min取球剖开并测定红墨水渗透的厚度,直到微球被红墨水完全渗透为止。根据公式(5)计算渗透率(%):1.2.5.4-密度计算方法取50粒大小、形状相近的微球,称量记录质量,置于盛有一定体积水的量筒中,记录体积差。按照密度公式,计算固定化微球的密度。1.2.6最佳固定化金融的确定在交联剂CaCl2溶液浓度为4%,交联温度为4℃,交联pH为6~7条件下,考察不同SA浓度(1%、2%、3%、4%、5%),活性炭含量(0.2%、0.5%、0.7%、1%、1.5%),交联时间(12h、18h、24h、30h、36h),种子菌浓(用OD600表示)(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0)对微球物理性质和原油降解率的影响,并通过正交试验,确定固定化微球的最佳制备条件。1.2.7固定化菌和游离菌的降压条件优化1.2.7.固定化菌接种量的确定在25℃,pH7~8,盐度3%,含油0.2%的无机盐培养基中,改变固定化微球与含油培养基体积比(1:20、1:10、3:20、1:5、3:10),130r/min摇床中培养7d,分别测定原油降解率,以确定最佳的固定化菌接种量。1.2.7.游离菌接种将处于生长对数期的Bai-1菌液离心,用蒸馏水配制成吸光度为1.5的种子菌液3mL,均分为2份,一份用于固定化微球制备(按实验方法1.2.3节中步骤制成15mL加菌微球),另一份用于游离菌接种。(固定化菌以加15mL不含菌微球为空白样,游离菌以不加菌液为空白样)。在25℃,含油0.2%的无机盐培养基中,130r/min摇床中培养7d,分别测定不同pH(6、7、8、9、10)和不同盐度(1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)对原油降解率的影响,以确定固定化菌和游离菌的最佳降解pH和盐度范围。2结果与讨论2.1生长停位管理由细菌Bbai-1生长曲线(图1)可知,0~2h为生长停滞期,2~9h为生长对数期,10h以后为稳定期。由于处于生长对数期的菌活性最高,因此,对该菌进行固定时,应选择生长对数期的Bbai-1作为包埋种子菌液。2.2关于碳化合物性质的测定2.2.1活性炭吸附时间的确定由菌浓(吸光度)随时间变化曲线(图2)可知,活性炭在前3小时的吸附速率较快,6h后吸光度基本不再随时间变化,说明活性炭对菌的吸附饱和时间为6h。2.2.2活性炭对抗菌性的影响根据实验方法1.2.3节,测得活性炭吸附前后Bbai-1的OD600,根据公式(1)换算成菌浓,实验结果见表1,可测得活性炭对菌Bbai-1最大吸附量为1.82×109cell/g。2.2.3球需25min不添加活性炭的微球完全渗透需40min,而添加0.5%活性炭的微球只需25min(图3)。可见,在固定化微球中添加适量活性炭,能增强载体的通透性,增大固定化颗粒的孔径,更有利于固定化菌与外界进行营养物质和溶解氧交换,保持活性,使固定化微球的传质性得到明显提高。2.3采用海藻酸钠-活性炭固定化微球制备条件2.3.1sa浓度对固定化微球性能的影响固定CaCl2溶液浓度4%,CaCl2溶液的pH值为6~7,活性炭含量为0.5%,交联温度为4℃,交联时间为24h,包埋菌浓(用OD600表示)为2.0,微球与含油培养基体积比为1:10,原油降解的温度为25℃,pH为7~8,盐度为3%。改变SA浓度,测定微球性能,见表2。由表2可知,固定化微球的半径、密度和机械强度均随SA浓度增加而增大,这是由于溶液粘性与SA浓度成正比,在适当的SA浓度范围内有利于微球成形;当SA浓度过高时,成球不规则,载体通透性降低,导致原油降解率下降。因此,SA的适宜用量为3%~4%。2.3.2活性炭对微球降解原油的影响为优化海藻酸钠-活性炭固定化微球的活性炭含量,设定海藻酸钠浓度为3%,其他条件同2.3.1节,改变活性炭含量,测定固定化微球物理性质和原油降解率,见表3。由表3可知,随着活性炭含量的增加,微球的降解率和机械强度均先增后减。这是由于在微球中添加适量活性炭可提高其传质性,并加速原油和溶解氧在微球表面的吸附平衡,更利于菌保持活性。当活性炭含量大于1.5%时,微球在原油降解过程中会有大量溶胀,导致实验无法继续进行。因此,活性炭适宜用量为0.5%~1.0%。2.3.3交联时间对微球降解率的影响为确定海藻酸钠-活性炭固定化微球的最佳交联时间,设定SA浓度为3%,活性炭含量为0.5%,其他条件同2.3.1节,改变交联时间,测定微球的机械强度和降解率见图4。由图4可知,微球的机械强度随着交联时间的增加而增大,但原油降解率在交联24h后急剧下降。因为交联时间过短,海藻酸钠凝胶未得到完全交联,微球机械强度和微生物活性较低;交联时间过长,会降低载体的传质性能,且长时间低温下的交联反应也会降低固定化微生物的活性。因此,最佳交联时间定为18~30h。2.3.4od400对微球降解性能的影响为确定固定化微球包埋的最佳种子菌浓(用OD600表示),设定海藻酸钠浓度为3%,活性炭含量为0.5%,交联时间为24h,其他条件同2.3.1节,改变OD600,测定微球性能见图5。由图5可知,随着OD600的增大,机械强度急剧减小,降解率先增后减。实验中,当OD600大于2.0时,微球在降解过程中产生溶胀,致大量小球破碎,使实验无法继续进行。这是由于微球内菌浓过大时,菌的过度增殖对海藻酸钙凝胶有一定的破坏作用。降解率主要取决于吸附在微球表层的细菌数量,微球内部的菌大部分处于休眠甚至死亡状态。当微球包埋菌浓过大时,大量菌会由于空间狭小,营养物质和溶解氧的缺乏而死亡,致固定化微生物活性降低,降解率则会下降。因此,选择OD600为1.0~2.0的种子菌浓较好。2.3.5固定化微球最佳包埋方案的确定为了优化固定化微球的最佳制备条件,本实验采用正交试验对SA浓度,包埋种子菌浓,交联时间和活性炭含量进行了优化。基于本实验已得数据,将SA浓度(因素A)设为3.0%、3.5%、4.0%,种子菌浓(用OD600表示)(因素B)设为1.0、1.5、2.0,交联时间(因素C)设为18h、24h、30h,活性碳含量(因素D)设为0.5%、0.7%、1.0%。采用正交表L9(34)(表4)确定的由各因素不同水平组成的9组实验方案制备的固定化微球,以降解率为评价指标安排实验。表4给出了各因素不同水平下的试验结果之和,并分别用K1、K2、K3表示,可判断各因素均以水平2最佳。又根据表4中极差R值,可知各因素主次顺序为:C(交联时间)>B(种子菌浓)>A(SA浓度)>D(活性炭含量),说明交联时间和种子菌浓对微球活性的影响最为显著。综合考虑各因素,确定固定化微球最佳包埋方案是:A2B2C2D2。即:SA浓度为3.5%,活性炭含量0.7%,交联时间为24h,种子菌浓(用OD600表示)为1.5,根据公式(1),种子菌浓为6×107cell/mL(对应的微球包埋菌浓为6×106cell/mL)。由于表5中未列出此方案,后补做了实验,由A2B2C2D2方案制得的固定化微球降解率为50.08%,机械强度为65.3mN,均优于其他方案结果,此最佳方案得到验证。方差分析结果(表5)显示,交联时间和包埋菌浓对降解率影响最为关键,其它因素在此试验范围内没有显著差异,对测定结果的影响较小,与直观分析结果(表4)相吻合。2.4接种量对固定化菌的降解的影响为了确定固定化Bbai-1降解原油的最佳条件,在25℃,0.2%的含油培养基中,分别改变固定化微球的接种量(用固定化微球与含油培养基的体积比表示)、pH和盐度,以游离菌作对比,测定降解率(表7)。从表7中可知:(1)当接种体积比小于0.15时,降解率随接种量增大而增大;大于0.15时,降解率急剧下降;大于0.3时,固定化微球在降解时大量破碎,使实验无法继续进行。可见,选择体积比3:20(0.15)较好。这是由于接种量过小,即菌浓较低时,降解率较低;但接种量并非越大越好,由于含油培养基中营养物质和溶解氧是一定的,接种量过大,不仅会增加成本,由于传质性下降,还会使大部分固定化菌处于缺氧和贫营养状态,降解率也随之下降。(2)游离Bbai-1菌的最适降解pH为7~8,最适降解盐度为2.0%~2.5%,最大降解率