异养硝化-好氧反硝化双重功能细菌cpz24的筛选鉴定及其功能研究

异养硝化-好氧反硝化双重功能细菌cpz24的筛选鉴定及其功能研究

近年来，我国畜牧养殖规模不断扩大，环境污染问题日益严重。其中，氮污染在山羊养殖废水中最为突出。许多池塘废水中的氨氮超标，超标率超过80%。由于氮超标，水体富营养化和严重的环境污染已成为世界难题。因此，尤其是关于牛磺酸废水中氮分解的研究是特别有价值的。目前，在水污染环境处理中，微生物脱氮法与物理和化学法相比，其优点不能被比较效果、低效率和二次污染所证明，是环境科学和水处理领域的关注和研究主要内容。这方面的技术研究取得了[7、8、9、10、11、12、13、14、15]。同时硝化与反硝化(simultanousnitrificationanddenitrification,SND)可使硝化和反硝化反应在同一反应器内同时完成,节省反应空间,缩短反应时间,平衡了反应条件,还克服了传统生物脱氮的很多弊端,被认为是在废水生物脱氮中具有很大的研究价值和应用前景,近年来国内外对同时具有异养硝化功能-好氧反硝化功能菌的研究尚处于起步阶段,将其应用于畜禽养殖废水治理中的研究报道更不多见.为此,本实验尝试从畜禽养殖废水中筛选具有此类功能的微生物,并对其硝化功能和反硝化性能进行研究,以期为更有效更经济更快速地去除畜禽养殖废水中氮的实验研究提供一定的理论依据;也为治理水体富营养化,恢复健康的生态环境提供一定的科学根据.1材料和方法1.1细菌的来源实验所用样品采自养猪场的废水和浅层底泥.1.2培养基和分析方法富集培养基:(NH4)2SO40.5g,琥珀酸2.17g,维氏盐溶液50mL,溶解后用蒸馏水定容至1L(固体培养基,则加入2%琼脂).维氏盐溶液:K2HPO4·3H2O6.5g,MgSO4·7H2O2.5g,NaCl2.5g,FeSO4·7H2O0.05g,MnSO4·H2O0.04g,溶解后用蒸馏水定容至1L.异养硝化培养基:(NH4)2SO40.24g,琥珀酸钠2.81g,其它成分与含量同富集培养基.好氧反硝化培养基:KNO30.36g,Na2HPO4·7H2O7.9g,KH2PO41.5g,MgSO4·7H2O0.1g,琥珀酸钠2.81g,微量元素溶液2mL,溶解后用蒸馏水定容至1L,pH7.0～7.5.微量元素溶液:EDTA50.0g,ZnSO42.2g,CaCl25.5g,MnCl2·4H2O5.06g,FeSO4·7H2O5.0g,CuSO4·5H2O1.57g,CoCl2·6H2O1.61g,溶解后用蒸馏水定容至1L,pH7.0.GN培养基:KNO31.0g,L-天冬酰胺1.0g,用酒精稀释0.1%的百里酚蓝(BTB)5mL,柠檬酸钠8.5g,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O1.0g,CaCl2·6H2O0.2g,FeCl3·6H2O0.05g,溶解后用蒸馏水定容至1L,pH7.0.1.3菌株筛选1.3.1最优富集液的制备取10mL水样和10g泥样分别接入相同的装有90mL已灭过菌的富集培养基中(泥样中加入几粒玻璃珠,利于打散污泥絮体),于30℃、120r/min摇床培养.经多次富集培养,通过格里斯试剂和二苯胺试剂检测样品中氨氧化菌的存在,并选取镜检下菌落大、数量多的作为最优富集液.1.3.2筛选氨氮降低量富集液中分别吸取1mL菌液,加入100mL新鲜液体异养硝化培养基中,30℃、120r/min摇床培养2d.检测氨氮量,将氨氮降低的样品重复以上操作2次.对氨氮降低较明显的样品进行极限稀释.样品分别稀释105、106、107倍,将稀释液移入100mL新鲜液体异养硝化培养基中,30℃、120r/min摇床培养2d.检测其氨氮降低量,筛选出氨氮降低最多的样品,进行多次分离纯化,挑取单菌群落作为初筛菌进行保存.1.3.3复筛菌种的筛选将若干初筛菌再次进行氨氮和总氮降解率的测定,挑选出降解率较高的菌株.将其接种到GN显色培养基上,30℃培养24h,能使GN培养基由绿色变成蓝色的菌株作为复筛菌.1.4细菌的鉴定将分离筛选到的CPZ24菌株经中国科学院微生物研究所根据其细胞形态、生理生化特性以及16SrDNA序列测定分析等作出菌株初步鉴定.1.5测定了细菌的性能1.5.1小鼠体内d值测定将5%的活化后的菌液接种于100mL新鲜异养硝化培养基中,30℃、120r/min摇床培养,每隔2h取样在600nm处检测菌体细胞D值.1.5.2体异养培养基将5%的接种量接种于100mL新鲜液体异养培养基中,30℃、120r/min摇床培养,每隔2h检测氨氮浓度、亚硝酸盐氮浓度、硝酸盐氮浓度以及总氮浓度.1.5.3菌株细胞d值测定将5%的活化后的菌液接种于100mL新鲜液体反硝化培养基中,30℃、120r/min摇床培养,每隔4h取样在600nm处检测菌体细胞D值.1.5.4反硝化培养基所需碳源检测将5%的接种量接种于100mL以硝酸钾为唯一氮源,琥珀酸钠为唯一碳源的反硝化培养基中,30℃、120r/min摇床培养,每隔4h检测硝酸盐氮浓度、亚硝酸盐氮浓度以及总氮浓度.1.6水质分析氨氮采用靛酚蓝分光光度法;硝酸盐采用紫外分光光度法;亚硝酸盐采用重氮化偶合分光光度法;总氮采用过硫酸钾紫外分光光度法.2结果与讨论2.1srdna分析经富集和分离,得到1株既能异养硝化又能好氧反硝化的菌株,其编号为CPZ24.该菌株菌落颜色为橙红色,菌体形态为杆状(图1),革兰氏染色阳性.对菌株16SrDNA进行序列测定,得到长度为1438bp的序列.该菌株经中国科学院微生物研究所对其细胞形态、生理生化特性以及16SrDNA序列测定分析,确定为Rhodococuuspyridinivorans.2.2cpz2菌株的生长周期对菌株CPZ24的生长曲线进行测定,其结果如图2.由菌株细胞生长密度D值的变化可知,CPZ24菌株在0～6h为适应期,6h开始进入对数生长期,20h达到最大生长量,之后菌株进入稳定生长期.2.3异养硝化作用对CPZ24菌株的异养硝化作用进行研究,由图3可知,氨氮起始浓度为50mg/L,反应进行到20h,该菌可将培养基中的氨氮全部去除,对总氮的去除率可达到98.70%.比林燕等在异养细菌的分离及其硝化特性实验研究中所筛菌株脱氮效率高.将菌株CPZ24氨氮质量浓度曲线和菌株生长曲线进行比较可以看出,菌株的生长与氨氮的脱除同步进行,氨氮去除最快的时期正是菌体生长的对数生长期,而在菌株达到最大生长量时,氨氮亦全部去除.随着菌株的生长,本研究跟踪菌株对其它指标的变化可以看出,整个反应过程硝酸盐氮和亚硝酸盐氮积累较少,在反应进行到18h积累量最大分别达到5.08mg/L和0.77mg/L,亚硝酸盐氮浓度的对数增加出现在菌体的对数生长期,这表明硝化作用主要发生在菌体的对数生长期,目前报道异养硝化作用时间不一,本实验中CPZ24菌异养硝化作用与细菌的生长几乎是同步的.从氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮浓度变化分析,反应过程中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮只有少量的积累,但远远小于氨氮的减少量.推断氨氮的可能代谢途径,一部分氨氮没有经过硝酸盐氮这一形态而直接脱出系统或是系统不单存在异养硝化作用而且具有较高的好氧反硝化作用,从而导致对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的积累较少.这与杨宗政等报道基本一致.氨氮全部去除后,硝酸盐氮和亚硝酸盐氮还有下降的趋势,且最终总氮的去除率达到98.70%,也说明了系统不仅具有异养硝化作用还存在好氧反硝化作用.2.4cpz2菌株的生长特性最近研究表明有一些异养硝化菌还具有好氧脱氮的能力.本研究对CPZ24菌株也进行了好氧反硝化性能进行测定.该菌株在以硝酸钾为唯一氮源,琥珀酸钠为唯一碳源的反硝化培养基中生长且保证好氧环境,菌株的生长曲线变化如图4所示.CPZ24菌株在0～4h为适应期,4h开始进入对数生长期,16h达到最大生长量,之后进入稳定生长期.2.5菌株的确定对菌株的好氧反硝化作用进行测定(图5),硝酸盐氮的浓度由开始的50.0mg/L降低到16.60mg/L,去除率达到66.74%,总氮的去除率达到64.27%.将菌株CPZ24的好氧反硝化作用曲线图与其生长曲线图进行对比可知:在整个反应过程中,菌株在对数生长期时硝酸盐氮浓度急剧降低,而在菌株进入稳定期后,硝酸盐氮浓度降低的趋势趋于缓慢;亚硝酸盐氮的积累主要在菌株的对数生长期,12h达到最大积累量5.92mg/L.菌株进入稳定期后,溶液中亚硝酸盐氮的浓度有所下降但一直处于很低的水平.Lesley等认为通过测定异养硝化细菌积累亚硝酸的量来确定该菌体的硝化强度,得出的数据往往很小,主要由于一些异养硝化细菌能同时进行反硝化作用,硝化作用与反硝化作用处于一种平衡状态,使得亚硝酸不能在溶液中积累,本研究的结果与之相符.由此也可知该菌的反硝化作用主要发生在菌株生长的对数生长期.目前,虽然把具有特殊脱氮功能的微生物应用于环境科学中有很多,但是把同时硝化反硝化脱氮功能的菌株投向实际畜禽养殖废水污染治理还很少,而该菌株虽然在实验室条件下已达到了一定的脱氮效果,但要将其应用于实际生产中还需对其生态环境效应以及在实际废水中的使用方法等进行深入的实践研究.今后可在该研究结果基础上,综合考虑和优化各种因素对其脱氮效果的影响程度,并结合其它功能微生物菌剂或水体净化植物相互协同作用,使菌株CPZ24对畜禽养殖废水中氮的去除效果达到最佳.目前已被正式描述的具有硝化功能的Rhodococcus属包括Rhodococcusrubber、Rhodococcusfascians,而本实验所筛选到的Rhodococuuspyridinivorans为首次发现具有同时异养硝化-好氧反硝化脱氮功能.3菌株的活性测定(1)采用极限稀释和显色培养基筛选相结合的方法,从畜禽养殖废水中筛选到1株能同时具有异养硝化和好氧反硝化的功能菌.(2)该菌生长情况较好,异养硝化与好氧反硝化作用均发生在菌株的对数生长期.在氨氮初始浓度为50mg/L时,菌株经过20h能将培养基中的氨氮全部脱除,且总氮最大去除率达