槲皮素提取纯化工艺的研究

槲皮素提取纯化工艺的研究

蝗虫是指豆科植物蝗虫sophorial干燥的花蕾。蝗虫主要含有芦丁、桦皮醇、二醇和槐树米a、乙和丙、奎科黄素等。芦苇根可以通过酶或酸转化为友皮素。研究表明:槲皮素有抗癌防癌、抗血小板聚集、镇痛、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗过敏、抗自由基及抗氧化等多种生物活性,且对人体无毒、无害、无致死、致癌、致畸、致突变等作用,近年来,许多国内外医药工作者都热衷于对槲皮素的提取、分离、检测及药理作用等方面的研究。本文对从槐米中制备槲皮素的方法进行了研究探讨。以期得到纯度较高的样品,这对利用槐米中的槲皮素作为药效成分的中药制剂以及利用槐米来提取槲皮素具有一定的参考意义。1干燥花的测定聚酰胺薄膜为浙江黄岩四青生化材料厂产品。槐米经鉴定为豆科植物槐SophorajaponicL.的干燥花蕾。紫外分光光度仪(2401PC日本岛津),高效液相色谱(HPLC美国惠普),万分之一/十万分之一电子分析天平(上海产),槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所),甲醇为色谱纯,水为重蒸水,其它试剂均为分析纯。2方法和结果2.1芦丁提取液的制备芦丁提取流程见图1。槐米−→−−−石灰乳pH8∼9沸水提取→石灰乳pΗ8∼9沸水提取提取液→趁热抽滤→趁热抽滤残渣反复提取三次—→合并滤液−→−−调pH4∼5浓盐酸→调pΗ4∼5浓盐酸酸水液放置析晶→抽滤→抽滤沉淀干燥得粗芦丁—→按1∶200加水重结晶—→精制芦丁图1芦丁提取工艺流程示意图2.2槲皮素的制备槲皮素的制备流程见图2。精制芦丁—→1∶80加2%H2SO4—→直火加热2h—→冷却抽滤—→残杂水洗至中性—→95%乙醇重结晶、聚酰胺柱层析—→槲皮素纯品图2槲皮素制备流程示意图2.3影响甘蔗提取率和瓜氨酸产量和含量的主要因素2.3.1盐酸对芦丁出物的影响在其它条件不变的情况下,改变提取液酸沉时pH值进行实验,结果见表1。由表1可知,提取液用盐酸调节PH值是芦丁析出的关键,如果pH值大于或者等于5,则芦丁提出率将大大降低,析出物多为暗褐色杂质,而极少有黄色沉淀。所以酸沉时pH值在4以下为宜。2.3.2提取用酸量的确定在其他条件不变的情况下,改变用酸量(每次料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶80、1∶90)进行提取,共提取6次,结果见表2。由表2可知,随着提取用酸量的不断增加,产率有不断增加的趋势,槲皮素含量也不断增加。综合产率和含量来考虑,以每次料液比1∶80为宜。2.3.3水解时间及紫外光谱其他条件不变的情况下改变提取时间结果见表3。由表3可知,提取时间也会影响提出率,提取时间小于2h,随着时间的增加,产率不断增加。但提取时间大于2h,随着提取时间的延长,槲皮素的产率反而有下降的趋势,水解时间过短,则不能保证芦丁完全水解,时间过长则会造成能量不必要的浪费或造成反应物或产物的炭化,所以选择水解时间也非常重要,故以每次提取时间2h为宜。95%乙醇重结晶后的槲皮素上聚酰胺(140~160目)柱,依次用水,20%,50%,70%,90%的乙醇梯度洗脱,90%的乙醇洗脱液浓缩后再上聚酰胺(140~160目)柱,常压层析,依次用70%,90%乙醇洗脱,90%的乙醇洗脱部分浓缩后第三次上聚酰胺(140~160目)柱,苯∶甲醇(1∶1)洗脱,合并相同黄色流分,浓缩后得黄绿色结晶(槲皮素纯品)。紫外光谱UV:λmax,nm,255,301sh,370(MeOH);241sh,331,412(NaOMe);271,342sh,446(AlCl3);266,302sh,359,427(AlCl3/HCl);258sh,270,324,382(NaCAC);260,386(NaCAC/H3BO3),与槲皮素标准品的紫外光谱一致。2.4alcl3乙醇溶液法合成微量元素,黄绿色结晶,熔点315~317℃,(分解)紫外灯下显兰色荧光,加AlCl3乙醇溶液萤光变黄绿色,盐酸-镁粉反应显红色,а-萘粉-浓硫酸反应不显紫色。锆-枸橼酸反应:当加2%氯化锆甲醇液时显黄色,再加2%枸橼酸甲醇液用水稀释黄色不褪。2.5精密度与标准品对比硅胶G板,用甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)展开;3%三氯化铝乙醇液检识,紫外灯(365nm)观察,经展开、显色仅显示槲皮素的斑点,Rf值=0.66结果见图3,精制槲皮素与标准品在相应的位置分别显黄色斑点。2.6流动相gc/ms条件色谱柱ZorbaxC18(4.6mm×150mm),条件为流动相:甲醇-4.3%磷酸溶液(55∶45),流速为1.0mL/min,检测波长为254nm,柱温为30度(图4)。槲皮素的纯度95.8%。3样品的提取工艺1)由于芦丁在冷、热水中的溶解度差异极大,从槐米中提取槲皮素需先提取芦丁,再经水解后生成槲皮素,芦丁的提取方法主要有碱溶酸沉淀法、有机溶剂提取法、浸渍法等,其中以碱溶酸沉淀法最佳,生产上均采用该法。选择沸水溶液提取以破坏酶,而且在槐米中果胶和粘液质较多。提取液通常因含有大量粘稠的杂质而难以过滤,所以本文直接用水加石灰乳提取芦丁,方法更加有效,但应注意加硼砂以保护临二酚羟基,而且整个过程对酸度控制要求较高。2)酸水解得到的槲皮素有杂质,要用95%的乙醇重结晶,再上聚酰胺柱才能得到纯品。3)该工艺考察了影响槲皮素产率含量的主要因素,芦丁的提取率直接影响槲皮素的产率,芦丁沉淀