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文档简介
第四章核酸序列分析核酸序列分析,亦称核酸测序技术,简称测序。
1、基因层面的疾病确诊;
2、发现潜在疾病的发病风险;
3、对个体化用药提供指导;
4、指导生育健康的下一代;一、测序的意义
人类基因组计划(HumanGenomeProject-HGP)于1990年正式启动,其主要目标有:识别人类DNA中所有基因(超过10万个);测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列;将这些信息储存到数据库中;开发出有关数据分析工具;致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于2003年完成。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程,它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础,具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。造福人类的HGP1949年,FrederickSanger开发了测定胰岛素两条肽链氨基末端序列的技术,1953年测定了胰岛素的氨基酸序列。1950年,Edman提出了蛋白质的N端测序技术,后来在此基础上发展出了蛋白质自动测序技术。1965年,Sanger等发明了RNA的小片段序列测定法,并完成了大肠杆菌5SrRNA的120个核苷酸的测定。同一时期,Holley完成了酵母丙氨酸转运tRNA的序列测定。蛋白质和RNA的测序技术二、测序技术的建立1975年,Sanger和Coulson发明了“加减法”测定DNA序列。1977年,
Sanger在引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了双脱氧链终止法,使得DNA序列测定的效率和准确性大大提高。1977年,Maxam和Gilbert报道了化学降解法测定DNA的序列。DNA测序技术的建立DNA序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白质和RNA测序技术,成为现代分子生物学中最重要的技术。神奇的基因测序三、DNA测序技术的发展第一代DNA测序技术第二代DNA测序技术第三代DNA测序技术测序技术的发展双脱氧末端终止法(Sanger测序法)1970s同位素标记,手工1980s荧光标记,自动1990s毛细管电泳合成测序法(第二代测序)焦磷酸测序(Pyrosequencing,Roche/454)合成测序(Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa)连接测序(Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD)单分子测序技术(第三代测序)HelicosPacificBiosciences9
1994:3亿美元测定一个人类基因组(1:10)1984:30亿美元测定一个人类基因组2004:3千万美元测定一个人类基因组(1:100)2006:1百50万美元测定一个人类基因组(1:2000)2008:50万美元测定一个人类基因组(1:6000)未来目标:1000/100美元测定一个人类基因组2011:5000美元测定一个人类基因组2014:上万元测定一个人类基因组1、第一代DNA测序技术第一代DNA测序技术:传统的双脱氧链终止法、化学降解法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。第一代DNA测序技术包括:双脱氧链终止法、化学降解法、荧光自动测序技术。链终止法利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法,是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。F.Sanger(1980年诺贝尔奖获得者)(Thechainterminationmethod)与PCR反应类似。反应体系中包含:模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物;反应过程:变性-复性-延伸-终止Sanger双脱氧链终止法利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性,使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH,不能与下一个核苷酸聚合延伸,从而终止DNA链的增长。双脱氧链终止法基本原理:变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子。双脱氧链末端终止法测序原理示意图
链终止技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
如果测序反应产物被放射性标记:
通过放射自显影胶片上的带型,可直接读出DNA上的核苷酸顺序。
如果产物被一种荧光染料标记:
当他们通过电泳胶道时被激光照射而激发荧光时可被探测装置搜集,由此得到的信号生成与DNA序列相对应的带型或轨迹模式,从而实现DNA序列分析的自动化。凝胶电泳和序列读取如果进行自动化分析可以一次性读取1000bp序列DNA自动分析技术的测序反应体系主要包括:DNA模板
测序引物DNA聚合酶荧光标记荧光染料及荧光标记技术在DNA自动化测序中被广泛应用。DNA模板:
1.单链DNA模板2.双链DNA模板3.PCR产物DNA聚合酶:
1.大肠杆菌DNA聚合酶1大片段2.测序酶3.耐热DNA聚合酶荧光标记方案:
1.染料标记引物2.染料标记终止物3.内部标记通过M13mp载体获得单链DNA以测序M13mp噬菌体载体是专为得到单链DNA测序模板而设计的。Sanger法因操作简便,得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术,其中最重要的是荧光自动测序技术。荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。目前,应用最广泛的应用生物系统公司(appliedbiosystems,ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。
如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管,4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记,在通过毛细管时不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发,发出不同颜色的荧光,被CCD检测系统识别,并直接翻译成DNA序列。目前所用自动测序技术的改进3730
全自动测序仪用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.产物条带经过检测仪时给出特定信号,由计算机判读并记录。第一代全自动测序
——毛细管电泳测序用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,可使DNA的测序速度更为迅速。这种电泳装置有96个泳道,每次可同时进行96次测序,每轮实验不到2小时,1天可完成近千次反应。自动DNA测序仪的主要构成:1.测序反应系统2.电泳系统3.荧光检测系统4.电脑分析系统
自动DNA测序仪的种类:
第一类采用“单染料/四泳道”第二类采用“四染料/单泳道”
测序策略
定义:测定未知DNA序列的方案,
即应该通过具有最小重叠、最少数量的测序反应,能拼接成目的DNA正确的序列。对于一个待测DNA分子,要制定一个能够简捷准确的测定方案,应考虑:1.DNA片段大小2.背景资料3.测序目的4.实验条件测序策略确证性测序策略:对已知序列的次级克隆或PCR产物进行鉴定和证实。未知DNA序列的测定策略对于较小的目的DNA片段(如小于1KB),可以直接利用M13mp或质粒系统克隆、测序。对于数千个碱基的大片段未知序列DNA,乃至数亿个碱基的生物基因组,必须将其切割成适当大小的各个片段(如小于1KB)分别进行次级克隆再进行测序,最后拼接全序列。2、第二代DNA测序技术新一代测序技术也称第二代测序技术,使用接头进行高通量的并行PCR和并行测序反应,并结合微流体技术,利用高性能的计算机对大规模的测序数据进行拼接和分析。
商品化的测序平台主要有:罗氏/454公司的GSFLX测序平台、Illumina公司的GenomeAnalyzer测序平台ABI公司的SOL2iD测序平台。基本原理:
先进行文库制备,即将片段化的基因组DNA两侧连上通用接头;随后运用PCR技术扩增技术来产生几百万个空间固定的DNA簇,这种DNA簇由单个文库片段的多个拷贝组成,称PCR克隆陈列或(称聚合酶克隆),最后进行测序,即测定每个克隆的核苷酸序列。
这些反应能大规模的同时进行,然后对每一步反应所产生的信号进行同时检测,以此来获取测序的数据,经过计算机分析获得完整的DNA序列信息,能实现一次对几百万条DNA分子进行序列测定。工作流程:
文库制备DNA簇的产生测序边合成边测序
焦磷酸测序技术
连接测序第二代测序技术不需要进行DNA模板克隆。第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。第二代测序技术最大的优势在于其测序通量的持续增长,具有很大的发展潜力。第二代测序技术并不完美,由于其在测序前要通过PCR手段对待测片段进行扩增,因此增加了测序的错误率。并且其测序结果比较短,更适合重测序,而不太适用于没有基因组序列的全新测序。第二代测序技术的应用1.从头测序、重测序和个体基因组测序2.个体基因组测序和SNP研究3.转录组及表达谱分析4.小分子RNA研究3、第三代DNA测序技术
最近,以单分子DNA进行非PCR的测序为主要特征的第三代DNA测序技术已经出现,
如生物科学公司(BioScienceCorporation)的HeliScope单分子测序仪。第三代测序技术的目标是:
实现人全基因组3分钟的测序时间及5000美元的测序价格。高通量单分子测序原理第三代测序技术获重大进展基因测序乱象多思考题1.第一代DNA测序技术的核心技术A.Sanger的双脱氧链终止法B.Maxam和Gilbert的化学降解法C.荧光标记技术D.PCR技术E.DNA自动分析技术2.Sanger双脱氧链终止法使用的链终止物A.NTPB.dNTPC.ddNTPD.a-32P-dNTPE.a-35S-dNTP3.不适宜于直接作为第一代测序技术测序的DNA模板A.双链DNA片段和PCR产物B.单链DNA片段C.克隆于质粒载体的DNA片段D.克隆于真核载体的DNA片段E.提取的染色质DNA4.DNA自动化测序技术一般不用到的技术A.Sanger的双脱氧链终止法
B.Maxam和Gilbert的化学降解法C.荧光标记技术D.PCR技术E.电泳技术5.不是自动DNA测序仪的主要系统之一A.测序反应系统B.电泳系统C.荧光检测系统D.探针荧光标记系统E.电脑分析系统6.要制定一个能够简捷准确的DNA测定方案,一般应考虑A.DNA片段的大小B.背景资料C.实验条件D.测序目的E.以上都是7.第二代测序技术一般不用到A.双脱氧链终止法B.文库接头C.高通量的并行PC
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