淹水过程中甜樱桃两种木根的酶活性变化

淹水过程中甜樱桃两种木根的酶活性变化

杏仁是多种养分和菲涅耳的一种丰富而有效的树种之一。虽然它是近年来快速发展的树种之一，但其生产中的樱桃显示出不适应洪水。2001年和2003年，由于大量降雨，烟台地区的大型甜樱桃受害者，一些果园的受害者。因此，洪水是阻碍甜樱桃发展的重要因素之一。低氧环境中的植物根系,需要糖酵解提供能量,诱导产生了许多参与无氧呼吸的酶,包括PDC、ADH和LDH等,并产生许多糖酵解末端产物,如乙醛、乙醇、乳酸、丙氨酸等。其中乙醛、乙醇是乙醇发酵途径中PDC、ADH的催化产物,乳酸是LDH的催化产物。有研究认为乙醇、乙醛积累是造成细胞伤害的主要原因,而乳酸积累引起细胞pH急降造成细胞质酸化也被认为是造成细胞伤害的另一主要原因。目前国外在缺氧胁迫下植株发酵活性和光合能力及拟南芥中乙醇发酵途径酶基因诱导方面有所研究。但对淹水条件下不同类型砧木根系无氧呼吸酶及发酵产物变化比较研究未见报道,本研究选用生产上常用且抗涝性有差异的甜樱桃砧木-东北山樱桃和马哈利(嫁接品种为美早)为试材,拟比较分析导致两种砧木对淹水敏感性差异的可能原因,为生产上砧木选择提供理论依据。1材料和方法1.1泥瓦盆栽植处理将1年生美早/东北山樱桃(PrunusserrulataG.Don)(T1)和美早/马哈利(PrunusmahalebL.)(T2)甜樱桃植株于2006年3月定植于上口径25cm,下口径22cm,深20cm的泥瓦盆中。土壤类型为壤土,每盆一株,正常管理,并于2006年8月7日在山东农业大学根系研究室作如下处理:选取长势一致的盆栽美早/东北山樱桃和美早/马哈利淹入水中,淹水在自然条件下进行,采用“双套盆法”,将种植植株的泥瓦盆置于直径为30cm,深28cm的塑料桶内,保持水层高于盆土表面2cm左右。取样时每2株为一单位,3次重复,分别在淹水0、24、48、72、96、120h时取样测定。1.1.1粗酶液的提取选取长3～5cm、直径1.5mm左右的生长根、褐色木质根,各称取0.5g左右,放入预冷研钵中,再加入预冷的酶提取液:50mmol·L-1Tris-HCl(pH6.8),内含5mmol·L-1MgCl2、5mmol·L-1β-巯基乙醇、体积分数为15%甘油、1mmol·L-1EDTA、1mmol·L-1EGTA和0.1mmol·L-1苯甲基磺酰氟,冰浴研磨后,于4℃12000×g离心20min提取粗酶液。1.1.2表面活性剂的启动反应用日本岛津UV-2450紫外分光光度计,测定PDC、ADH和LDH在340nm处吸光值变化。丙酮酸脱羧酶(PDC)活性测定:反应混合液为50mmol·L-1MES(pH6.8),含25mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1MgCl2、0.5mmol·L-1TPP、2mmol·L-1DTT、0.17mmol·L-1NADH、50mmol·L-1草氨酸钠、10UADH,用10mmol·L-1丙酮酸启动反应。乙醇脱氢酶(ADH)活性测定:反应混合液为50mmol·L-1TES(pH7.5),含2.5μmol·L-1NADH,用0.125mmol·L-1乙醛启动反应。乳酸脱氢酶(LDH)活性测定:反应混合液为0.1mol·L-1磷酸(pH7.0),含4μmol·L-1NADH、0.24mmol·L-1丙酮酸,用酶提取液启动反应。1.1.3加磨机研磨法参照田世平方法,选取长3～5cm、直径1.5mm左右的根系,称取1g,用1ml浓度为20%TCA冰浴研磨,样品研碎后置于青霉素小瓶中,加盖密封。测定时,先将样品放在45℃的热水浴中1h,用注射器在瓶顶部抽取0.5ml的气样,用装有FID的日本岛津ShimadzuGC-9A型气相色谱仪测定乙醛、乙醇含量,色谱柱温100℃,检测温200℃,载气N2和H2流速为30ml·min-1,样品浓度采用外标法计算。1.1.4u3000专有液的制备参照赵尊行方法,选取长3～5cm、直径1.5mm左右的褐色木质根,称取3g左右,用20ml80%酒精研碎,转移至50ml离心管中,于75℃下浸提25min,然后4000r/min离心10min,转移上清夜至50ml容量瓶中,之后同样条件分两次用15ml80%酒精洗残渣,再离心收集上清夜,合并,定容至50ml。摇匀后取6ml蒸干,残渣用2ml流动相溶解后,经0.22μm滤膜过滤后移入1.5ml离心管中保存供色谱分析用。采用美国Waters510型高效液相色谱仪测定乳酸含量,测定条件:波长210nm,色谱柱为ODSC18反相柱,检测器Waters2487,用过0.22μm膜pH2.55重蒸水配制的18mmol/LKH2PO4溶液作流动相,流速0.8ml/min,柱温为30℃,进样量10μl,采用外标法计算乳酸含量。试验结果均采用SAS软件Duncan多重比较法(P<0.05)进行统计分析。2结果与分析2.1浸泡水对挑选甜樱桃根系的无声呼吸酶pdc、adh和ldh的影响2.1.1．3雨水过程中叶片pdc活性的变化图1A显示,淹水前T1生长根PDC活性高于T2。淹水过程中T1、T2PDC活性先升后降,二者PDC活性在淹水48h时均达最大值,其中T1为0.381μmol·mg-1protein·min-1,T2为0.889μmol·mg-1protein·min-1。最终T2PDC活性比淹水前增加76%,T1PDC活性比淹水前增加24%,T2PDC活性增幅大于T1。T1、T2褐色木质根PDC活性与生长根PDC活性整体变化趋势基本一致,即淹水过程中该酶活性先升后降(图1B)。淹水24h时T2PDC活性达最大值为0.160μmol·g-1FW·min-1,而T1PDC活性淹水48h达最大值0.142μmol·g-1FW·min-1。最终T1褐色木质根PDC活性为淹水前的2.39倍而T2PDC活性为淹水前的3.17倍。比较图1A和图1B,淹水过程中,生长根PDC活性变化幅度大于褐色木质根。2.1.2t1、t1dh活性淹水过程中生长根ADH活性变化均表现为先升后降(图2A),一经淹水两种砧木生长根ADH活性逐渐升高,至72h时二者ADH活性同时达最大值,分别为2.725μmol·g-1FW·min-1和3.986μmol·g-1FW·min-1,之后其活性开始下降,至96h时,T1ADH活性为淹水前的1.75倍,T2为淹水前的1.49倍。图中还可看出,T2生长根ADH活性均显著高于T1,但T1ADH活性增加幅度大于T2。实验范围内,T1、T2褐色木质根ADH活性呈上升趋势(图2B),淹水至120h时,T1ADH活性为1.186μmol·g-1FW·min-1,是淹水前的3.69倍,T2为1.684μmol·g-1FW·min-1,是淹水前的2.56倍,ADH活性增加幅度表现为T1>T2,与生长根一致。比较图2A、B,生长根在淹水96h时ADH活性与淹水前相比已处于较低水平,而褐色木质根ADH活性在120h时仍未出现下降趋势,维持较高水平。2.1.3t1ldh活性生长根LDH活性先升后降,其变化如图3A所示。T1、T2淹水24h时生长根LDH活性即达峰值,分别为0.192μmol·mg-1protein·min-1和0.163μmol·mg-1protein·min-1,之后该酶活性急剧下降,淹水前48h,T1LDH活性高于T2并达显著性差异,至96h时,T1为淹水前的115%,T2为淹水前的107%。淹水过程中褐色木质根LDH活性变化与生长根趋势基本一致,即先升高后降低(图3B),但T1比T2出现峰值较早。比较两类根发现,淹水过程中褐色木质根LDH活性低于生长根,且褐色木质根LDH活性达峰值时间滞后于生长根。2.2浸泡水对培育甜樱桃中的乙醇、乙醇和脂肪酸含量的影响2.2.1情况1:未培养成分配的乙醛含量随淹水时间延长乙醛含量呈上升趋势(图4),且表现为T2乙醛含量高于T1(96h除外)。T1乙醛含量在淹水96h时后有所下降,淹水至120h时乙醛含量是初始值的167倍。T2乙醛含量淹水24h内即迅速升高,之后升高趋势变缓,至120h时T2乙醛含量为88.36μmol·g-1FW,是T1的1.18倍,比T1积累更多乙醛。2.2.2adh活性测定由图5可以看出,淹水过程中T1、T2根系中乙醇含量均呈上升趋势,这与淹水过程中ADH活性变化一致(图2B)且T1乙醇含量高于T2。在淹水前96h,乙醇含量变化相对较小,之后T1、T2乙醇含量骤升并达显著性差异,淹水120h时表现为T1乙醇含量高于T2。2.2.3其他乳酸含量T1乳酸含量在淹水初期即迅速增加,至48h时达最大值0.44μg·g-1FW,为初始值的4.89倍,是同期T2的6.29倍,之后乳酸含量急剧下降,淹水120h时基本恢复到初始值水平(图6)。淹水0～72h内T2乳酸含量变化不大,至96h时达最大值0.20μg·g-1FW。由图6还可以看出,淹水前48hT1乳酸含量远高于T2,72h后T2乳酸含量开始大于T1。3大力推进期e活性变化低氧胁迫下的植物根系,其糖酵解代谢产物丙酮酸通过三羧酸循环(TCA)途径产生ATP和NAD+的能力严重削弱。相反地,植物为了产生足够的ATP和NAD+维持细胞功能运转,无氧发酵途径作为一种短期适应方式出现。低氧条件下植物根系中的丙酮酸在许多无氧呼吸酶催化作用下,分别进入乙醇发酵途径、乳酸发酵途径等,继而产生乙醛、乙醇和乳酸等发酵产物,这些产物被认为是造成细胞受害的主要原因。本研究结果显示,淹水过程中不同甜樱桃砧木的两种根系类型中的无氧呼吸酶活性均发生显著变化,其褐色木质根无氧呼吸酶催化产物乙醛、乙醇含量均明显增加,两砧木褐色木质根中乳酸含量峰值出现在不同淹水时间段内,且远高于其初始值,表明无氧呼吸酶活性变化是植物根系响应淹水条件下能量匮乏的一种积极机制,而其催化的不同潜在有害终产物含量增加的差异则对细胞造成不同程度的伤害,酸性物质含量增加的时间和量的差异引起细胞质酸中毒程度不同,导致两种砧木对淹水的敏感性不同。PDC作为乙醇发酵途径中催化丙酮酸生成乙醛的关键酶,前人报道低氧条件下植物根系中PDC活性升高。本研究结果表明,甜樱桃根系淹水过程中PDC活性及其催化发酵产物乙醛含量变化具有阶段性,即一经淹水,生长根PDC活性明显升高,这与前人研究结果一致,随淹水时间延长,该酶活性逐渐下降且淹水过程中T2PDC活性增幅大于T1,表明生长根细胞受害较重,酶活性受到影响,整个淹水期间T2生长根中乙醛含量可能积累较多。褐色木质根PDC活性变化与生长根PDC活性变化趋势基本一致,但褐色木质根PDC活性变化幅度明显小于生长根,表明淹水过程中生长根PDC活性变化较褐色木质根相对剧烈,淹水至120h时已检测不到生长根PDC活性而褐色木质根PDC活性仍高于淹水前,进一步表明褐色木质根作为维持树体功能的器官受淹水影响的程度小于生长根。Perata和Alpi认为在胡萝卜细胞培养过程中,添加外源乙醇引起的毒害效果是由于乙醛的形成。对褐色木质根中乙醛含量测定表明,低氧条件下乙醛含量均明显升高,T1乙醛含量在96h达峰值后下降,这与T1褐色木质根ADH活性增加幅度大体吻合,即更多乙醛转化为乙醇,导致T1褐色木质根中乙醇积累较多,而T2褐色木质根PDC活性增幅大于T1且最终T2乙醛含量高于T1,认为乙醛含量积累的更多是T2受害的原因之一,与Perata和Alpi的研究结果一致。SuandLin对淹水的丝瓜根系研究认为,乙醛浓度并不与PDC活性的诱导成比例,乙醛浓度5d后才轻微增加,本研究结果证实了这一观点,即淹水后褐色木质根乙醛含量升高与PDC活性升高并非一一对应关系,PDC活性出现峰值时间较早,乙醛含量达峰值时间相对延迟,但乙醛含量升高与PDC活性升高(与初始值相比)的总趋势在淹水期间内呈时间段对应关系(图4、图1B)。乙醇发酵途径研究较多,该途径中ADH是研究的重点。已有研究表明,淹水明显促进玉米根系ADH活性,不耐涝品种活性的增幅高于耐涝品种。实验过程中发现,生长根和褐色木质根ADH活性均高于初始值,表明淹水促进了甜樱桃根系ADH活性的升高。T1两类根系ADH活性增加幅度均大于T2,表明T1比T2对淹水更敏感。Crawford和Baines认为许多植物有代谢乙醇的能力,在淹水和非淹水树的根和干中都可检测到乙醇,Nilsen和Orcutt认为根能耐淹水而不会死亡,必须把乙醇维持在可忍耐的水平,且能产生足够的ATP维持细胞的功能,Barclay和Crawford认为豌豆幼苗缺氧条件下乙醇超过60mmol/L阈值即造成缺氧死亡。对褐色木质根中乙醇含量研究结果表明,乙醇含量变化与褐色木质根中ADH活性增加幅度相吻合。T1褐色木质根中ADH活性增加幅度大于T2有可能造成其乙醇积累超过阈值导致T1褐色木质根细胞较早受害,而T2褐色木质根ADH活性增加幅度小,另外也可能T2褐色木质根代谢乙醇的能力较强,使乙醇积累没有超出某一阈值,虽对细胞造成一定伤害,但受害程度较T1轻,但造成甜樱桃根系细胞受害的乙醇阈值还有待进一步研究。Hoffman等对大麦的研究结果表明LDH在严重低氧条件下能保持长时间的高活性,而Huang研究认为随着细胞质pH值的下降,LDH活性受抑,Davies等人研究表明低氧初