多重修饰的纳米纳米粒的制备工艺及体外稳定性研究

多重修饰的纳米纳米粒的制备工艺及体外稳定性研究

人体的感知系统是大脑和环境之间的通道。鼻药后，药物可通过血脑屏障穿过大脑障碍，直接进入大脑和大脑。鼻腔给药虽具有一定的脑靶向性,但大部分药物仍会通过鼻黏膜吸收进入体循环而被网状内皮系统吞噬。纳米粒表面修饰可避免网状内皮系统吞噬而改善其脑靶向性。茴拉西坦(aniracetam)是内酰胺类脑功能改善和代谢增强药,用于治疗阿尔茨海默病、脑血管病后的智力和记忆减退等,中国已上市的有胶囊、片剂和颗粒剂等剂型,口服或注射后全身分布且肝清除率很高,不具备脑靶向性。现采用溶剂扩散-挥发法研究了多重修饰的鼻腔给药茴拉西坦载药纳米粒的制备工艺,初步评价了体外稳定性和释药特性。1实验部分1.1聚乳酸、聚糖盐和吐温80ZetasizerNanoZS90型激光粒度及电位分析仪(英国马尔文);1100高效液相色谱仪(美国安捷伦)。聚乳酸(山东省医疗器械研究所,Mw=15kDa);壳聚糖盐酸盐(上海卡博工贸有限公司,脱乙酰度80%～90%);茴拉西坦、F-68(美国Sigma);PEG-20000、吐温80(成都市科龙化工试剂厂);薄荷素油(黄山天目薄荷药业有限公司);冰片(四川利民中药饮片有限责任公司);溶菌酶(如吉生物科技);其余试剂为分析纯。1.2方法和结果1.2.1流动相3-3%甲醇-水相采用Welchrom-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),以甲醇-水(40:60)为流动相,检测波长284nm,柱温30℃,流速1mL·min-1,进样量10μL。1.2.2对照品溶液的制备取适量茴拉西坦对照品,精密称定,用甲醇溶解并配制储备液。精密吸取适量储备液,配制126.00、63.00、31.50、21.00、10.50、5.25、2.52μg·mL-1的对照品溶液,进样并记录峰面积。以样品浓度对峰面积进行线性回归,回归方程为:Y=14.639X+15.764(r=0.9989),线性范围为2.52～126μg·mL-1。1.2.3对照品溶液及其稳定性取3种不同浓度的茴拉西坦对照品溶液,1d内连续进样6次,记录峰面积,其RSD分别为1.68%﹑1.37%﹑0.75%。取3种不同浓度的茴拉西坦对照品溶液,在不同日期进样6次并记录其峰面积,其RSD分别为1.79%、1.64%、1.93%。3种浓度的茴拉西坦对照品溶液含量测定方法的日内和日间精密度均<2%,符合测定要求。1.2.4加标回收率试验分别配制高、中、低浓度的茴拉西坦对照品溶液,各取适量加入空白纳米粒溶液,于3.5×103r·min-1离心35min,取超滤液10μL,HPLC测定茴拉西坦含量,计算高、中、低浓度的回收率均>95%(RSD均<2.0%)。1.2.5纳米粒胶体选择超滤法测定包封率(ER)和载药量(DL)。取1mL制备好的纳米粒胶体溶液,置Millipore超滤离心管中,于3.5×103r·min-1离心35min,精密量取200μL滤液用甲醇定容到5mL。再精密量取200μL纳米粒胶体溶液,超声破坏后甲醇定容到5mL。HPLC测定茴拉西坦含量,计算纳米粒的ER和DL。1.2.6表面活性剂用量对纳米粒粒径的影响采用溶剂扩散蒸发法,制备茴拉西坦载药纳米粒,以ER、DL为考察指标,固定其他条件分别对投药量、减压旋转蒸发后纳米液的体积、水相体积进行了单因素筛选。以纳米粒粒径为考察指标,固定其他条件分别对水相体积、F-68浓度进行了单因素筛选。分别考察了3:10、1:5、2:15、1:10四种药物/聚乳酸的比值。结果显示:药物与聚乳酸的比例为2:15时所制备的纳米粒包封率较高,载药量最高,故选择药物与聚乳酸的比例为2:15。固定总体积40mL,分别考察了水相体积为10、15、20、25mL时对结果的影响。结果显示:水相体积增加,制备的纳米粒粒径减小,当水相体积为20mL时所制备的纳米粒包封率、载药量最高,且粒径适中。故选择水相体积为总体积的1/2。以减压旋转蒸发后纳米溶液的体积计,分别考察了纳米粒溶液终体积为7、5、4、3mL时对包封率和载药量的影响。结果显示:当<3mL时,包封率超过95%,因此,控制纳米溶液终体积不大于3mL。分别考察了0.5%、1%、2%、3%F-68浓度对粒径的影响。表面活性剂用量增加时,所制备纳米粒的粒径有减小的趋势,当表面活性剂浓度>1%时,对纳米粒粒径影响较小,因此,制备纳米粒选择表面活性剂浓度为1%。经单因素筛选并参照文献,多重修饰的茴拉西坦载药纳米粒具体制备方法为:精密称取150mg聚乳酸、20mg茴拉西坦与60mg冰片薄荷低共熔物溶于20mL丙酮-乙醇(3:2)的油相中,在磁力搅拌下,将油相逐滴加到20mL含1%F-68与100mgPEG-20000的丙酮水溶液(1:1)水相中,减压旋蒸,除去有机溶剂和少量水,得到纳米粒胶体分散体系,加入100mg吐温80,并在30℃下继续减压旋转蒸发至体积<3mL,离心,收集纳米粒,用超纯水洗涤3次,将离心收集的纳米粒重新分散在1%F-68的生物缓冲液(MES)中,加入5mg壳聚糖盐酸盐,磁力搅拌后,于30℃下减压旋转蒸发至体积<3mL,1.5×104r·min-1离心后,即得到PEG-20000、吐温80、壳聚糖、冰片薄荷多重修饰的茴拉西坦载药纳米粒,所得纳米粒包封率最高可达98.14%,载药量为11.57%。1.2.7纳米粒包材料的表征将茴拉西坦载药纳米粒用金负染后,采用扫描电镜观察拍照。多重修饰的茴拉西坦载药纳米粒形态圆整,大小均匀,单分散性好,图中黏连状物质为纳米粒包被材料(图1A)。在室温条件下,取纳米粒胶体溶液,用去离子水稀释,激光粒度分析仪分别测定粒径和Zeta电位。粒径为141.5nm(PDI为0.077),Zeta电位为20.4mV(图2)。1.2.8粒径和pdi值取1mL制备好的茴拉西坦载药纳米粒,分别加入1mL鼻洗液或1mg溶菌酶于37℃、100r·min-1恒温水浴温育2h,测得纳米粒粒径大小为149.1nm,PDI值为0.082(图1B),粒径分布见图3,说明其在鼻腔环境下稳定。1.2.9载戊拉西坦纳米粒的药物释放试验精密量取一定体积纳米粒胶体溶液,置处理好的透析袋中,以100mLpH7.4或pH4.0的0.1mol·L-1磷酸盐缓冲液为释放介质,于37℃磁力搅拌,转速200r·min-1,采用不完全漏槽法分别于0、5、30min和1、2、4、8、12、24h取样1mL,于1×104r·min-1离心,取10μL上清液进样测定。计算累积释药百分率(图4)。多重修饰的载茴拉西坦纳米粒在pH7.4和pH4.0的磷酸盐缓冲液中2h内药物释放可达70%,2h后释药缓慢增加,24h累积释药百分率大约88%。相比于茴拉西坦口服制剂,给药5min后即出现血药浓度峰值,纳米粒有一定的缓释作用。2壳聚糖修饰纳米粒纳米粒制备的初始胶体溶液体积为40mL,其中水相为1/2,旋转蒸发除去溶媒后,终体积对包封率影响较大。从释放曲线可看出:纳米粒有一定的突释效果,可能是由于药物吸附于纳米粒表面,可使血药浓度快速达到治疗浓度,有利于脑部转运和治疗。采用壳聚糖对纳米粒表面修饰的目的是利用其正电性和生物黏附性来增加纳米粒在鼻腔中的稳定性,延长鼻腔滞留时间,增加药物的鼻黏膜转运。但壳聚糖修饰纳米粒会出现黏