基因工程基本原理简介课件

第一节基因工程原理简介一、基因工程的定义本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因/DNA片段的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。

广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。目的基因获得表达载体构建基因的导入表达的鉴定核酸鉴定：PCR;SouthernandNorthernblot.蛋白鉴定：SDS;HPLC;Westernblot.功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。原核:包涵体,分泌型真核:文库合成PCR基因组文库cDNA文库细菌：氯化钙；电穿孔;细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V;动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V；载体质粒(plasmid)粘粒(cosmid)λ噬菌体(λ)第二节基因工程的基本步骤和方法第三节基因工程中的通用技术一、核酸的提取纯化与定量包括RNA、DNA及plasmidDNA的提取纯化技术四、Westernblot:Protein一、获得目的基因的方法

基因文库（cDNA文库和基因组文库），化学合成，PCR等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技术。（一）基因组文库目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。第四节基因工程中的常用技术家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与初步应用研究CloningandinitialapplicationoffunctionalpromoterofMuscadomesticayolkproteingene启动子克隆一般思路启动子区杂交增强子调控启动子核心启动子基因3’

5’转录起始点探针+50-40ATG-4000-500功能分析

克隆启动子实验一、家蝇部分基因组文库的构建

1材料与方法

1.1家蝇基因组DNA的提取

2.1基因组DNA的部分酶切

3.1EMBL3载体臂的制备

4.1连接与包装

5.1基因组文库鉴定

BclI随机酶切

左臂基因组DNA右臂

leftarm（20kb）centralstuff

14kbrightarm9kbEcoRIBamHISalIBamHＩSalIEcoRIＥＭＢＬ３基因组DNABamHI+CIPBclIBclIBamHIBamHI包装转化KW251噬菌斑

10~23kb包装蛋白实验一、技术路线图重组噬菌体收集噬菌体液基因组文库1.GenomicDNA2.LambaDNA

Fig.1electrophoresisofgenomicDNA图1.基因组DNA电泳1248.5kb

实验一结果2.1基因组DNA的提取提取的基因组

DNA大于50kbFig.2DigestionofgenomicDNAbyBclI1.5U/ugDNABclI，2.2.5U/ugDNABclI3.1.25U/ugDNABclI4.LambaDNA/HindⅢMarker图2.基因组DNABclI酶切电泳23kb9.4kb1234Fig.3Electrophoresisofrecoverproductsof10~23kbDNAfragments

1.BclI酶切纯化片段2.LambaDNA/HindⅢMarker图3.10~23kbDNA片段回收产物电泳23kb9.4kb

12

实验一结果2.2家蝇基因组DNA酶切和纯化纯化了10~23kb的BclI酶切DNA片段实验二、家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析

特异性探针噬菌斑原位杂交鉴定可疑阳性克隆亚克隆文库液转化KW251噬菌斑三次纯化噬菌斑原位杂交λ-DNA

提取

阳性克隆单酶切和双酶切SouthernBlotHindIIIXhoI目的DNA片段测序序列分析实验二、技术路线实验二结果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列2.1特异性探针制备

制备了大小为768bp的地高辛标记的DNA片段特异性探针，工作浓度为1：2000。实验二结果2.2阳性克隆的筛选和纯化1#positiveclone（about2000plaques/plate）Fig.3Screeningresultof1stroundsituhybridization图3第一次噬菌斑原位杂交筛选结果YP1

2#positiveclone（about200plaques/plate）Fig.4Screeningresultof2ndroundsituhybridization图4第二次噬菌斑原位杂交筛选结果Numbers：11positiveclone（11plaques/plate）Fig.5Screeningresultof3rdroundsituhybridization图5第三次噬菌斑原位杂交筛选结果获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆2.02.3

4.46.6

9.4231.4

1.6

2.0

3.5

4.3

5.0

21

123456

kbkbFig.6Digestionanalysisofrecombinantλ-DNAofpositiveplaque图6阳性克隆λ-DNA的酶切分析实验二结果2.3mdYP基因组基因的克隆1:LambdaDNA/HindⅢMarker2:XhoⅠ,3:XhoⅠ/HindⅢ,4:HindⅢ,5:SalⅠ6:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker3.5

kb1241:XhoI，2:HindⅢ3:XhoⅠ/HindⅢFig.7Southernblotofrecombinantλ-DNAofpositiveplaquewithmdYP1DNAprobeDIG-labeled图7阳性克隆λ-DNA的Southernblot实验二结果2.3mdYP基因组基因的克隆1ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA100101ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT200201AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA300301ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA400401TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT500501TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT600601TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT700701TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA800801ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG900901ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA10001001ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT11001101CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT12001201TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA13001301ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT14001401CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT15001501TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG16001601GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGAATCCATTGGGAG17001701TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA18001801GGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC19001901AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC20002001AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG2100获得了全长3991bp的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白基因组基因及其5’-调控区序列。2101AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG22002201CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC23002301ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG24002401AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC25002501TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC26002601TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG27002701CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA28002801TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA29002901ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA30003001AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT31003101TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA32003201AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT33003301TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG34003401AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA35003501GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT36003601TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT37003701TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC38003801CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC39003901TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG3991Fig.3ThesequenceofMuscadomesticaYP1genecontaining1.7kb5’flankingregion.Theintronregion(1886∽1947)ismarkedbyunderlining,theTATAboxortheAATAAsignalisinbold,ThetranslationinitiationcodonATGortranslationterminationcodonTAGisindicatedbyanopenbox。图3.卵黄蛋白基因组基因全序列实验三、家蝇卵黄蛋白基因启动子片段的克隆与功能分析

FP1RP1或RP2PCRFP2FP3P2P3+75’3’ATG+1启动子区FP4P4P1实验三、技术路线图补平T4Ligase表达质粒构建表达质粒构建TATAHindIIIP2P3TATAHindIIIHindIII酶切P5P6补平T4Ligase鉴定电转移转染pMYP1-GFPpMYP2-GFPpMYP3-GFPpMYP4-GFPpMYP5-GFPpMYP6-GFP转染Sf9昆虫细胞BHK-21细胞家蝇卵绿色荧光蛋白启动子活性荧光显微镜荧光显微镜2.2启动子片段的转录活性鉴定pMYP2-GFP质粒电转移结果pMYP3-GFP质粒电转移结果pMYP4-GFP质粒电转移结果TEbuffer电转移结果

实验三结果家蝇早期胚胎转基因前后的

差异表达研究2.DD-PCR技术5’N’M’AAAAAAAAAAAAAn细胞总RNA或poly(A)RNA

5’N’M’AAAAAAAAAAAAAncDNA3’NMTTTTTTTTTTTT简并锚定引物

进行PCR

随机十聚体NNNNNNNNNN——————————————————————NMTTTTTTTTTTTT持续循环

NNNNNNNNNN————————————

——————————NMTTTTTTTTTTTT

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳样品A样品B作Northern探针作cDNA文库筛选探针作亚克隆和测序样品反转录反应切取目的带,重新扩增,回收纯化

图3.家蝇早期胚胎转基因前后DD-PCR结果

1、3、5．转基因处理组T11MA-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP42、4、6．对照组T11A-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP4

图4.差异片段的二次PCR回收结果

1．DD-frag-62．DD-frag-53．DD-frag-3M．DL2000Marker

DD-frag-3：355nt

GGTACTCCAGTACAACTGATATCGTATGTTGAAATTCCTGCCGTGAGCAAAGCTCCCTTTGTAATAATCAGTACCCAAGAACAGGCAAACAAATAAATAACAGTTCTAAGTGAAATAACTGATGATCTACTATACAAAACTTATAAAGAGATAATAAGGTATTCGGTAATAAAATAAAAAAATAGTAAAGGTGGGTTCTTACTAATTATTCATTCAATAATAATAATCGAATGTATTACTGCTCCCTAAATCAACTAAACAGTTCTAATAGAGTTGAGGGAATGCATGCAGTAATATTCCTGTTGTAAAATTGAATGAAGCTCCAAACCTGTTCCAATGCAGGAGTATATCTGGA

DD-frag-5：432nt

GCAATCGATGTACGATGTTTAACAACAACAAGAGTAATTACACTTTCAATTTTCACTTGTCTAACCAAAATTCATGTTGTATGAATGTCAAAAAGAAAAGACGACGGGTAACAAAAATCGAAAGTGAGCAACAATCGATTCTGGTGACGACAAAATTCTTAAGCAAGAAATCATCATCTTAAGAACGAAACAACTCATTGACCTAGAATGTTGATTGACAACTTAATGCTTCACCACTAGACATTACTCGTCAGCTGGTTACATCGATTGTTAAACGTTTTCAAATCGAAACACTAGAAGATGGATAACCCGTGATTGGCTTTTCGTATTAAAGATAGATGTAAATCAACCGCGAATTGTTCAACAACAACCAAGCAAAGGAATCAACTGAACACATATCAAAGAGTGTTTGGCACTTTATATAAATACTTDD-frag-6：240ntGCAATCGATGTCACGATCGTAAGCGTTAACCAAAATTGCGTCCTCTAGAGATAGTATTCAACAAGCGATAATGGCCGTACTGAGGCAAATCTTTGTCATTCCCAAAAGTATGTTTCAGAAGCACCTTGGTAATAGTGCAAAATATAGGCCTTATTGAATTTTGACGAAATCTCTTTCATGATTTTAGTGCATCGATTGCATACAAACGCTCTTTTGTAAGCCAAGACATAGTTTCTCCA图8DD-frag-3（上）、DD-frag-5（A）与DD-frag-6（B）点杂交鉴定结果

1．阳性对照2.阴性对照3.家蝇基因组1．阴性对照;2.家蝇基因组;3．转基因处理组;4.对照组

三、重组质粒的构建与鉴定

1.工具酶：限制性内切酶