项目的意义必要性和依据近年来大量的研究证实间充质干细胞

（一）项目的意义、必要性和根据近年来大量的研究证明间充质干细胞（MSCs）是骨髓微环境细胞的来源细胞，是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSCs因其含有下列特点而日益受到人们的关注：(1)多向分化潜能：在体内/外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多个组织细胞；(2)造血支持和促植入：作为造血微环境重要细胞成分——基质细胞系的干细胞，MSCs通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多个细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干细胞的生长，与造血干细胞共同移植可增进造血干细胞的植入；(3)免疫调控：MSCs体现MHC-I类分子，不体现CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可克制混合淋巴细胞反映，体内诱导免疫耐受，对于防止和治疗异基因造血细胞移植后引发的移植物抗宿主病，诱导器官移植免疫耐受有较好的应用前景。(4)自我复制：MSCs作为干细胞能够自我复制，体外扩增、增殖能力强，能够作为基因操作的干细胞平台，在基因治疗中有着十分诱人的前景。在造血干细胞移植治疗恶性血液病的应用研究增进造血干细胞移植的造血重建：近年来有关MSCs体内、外支持造血，克制免疫功效的报道有诸多，提示MSCs能够作为造血干细胞移植的共移植手段以及应用于临床有关疾病的治疗，可提高造血干细胞移植患者的存活率和移植后生存质量，从而大大提高移植治疗的有效性和适应症，含有良好的应用前景。MSCs经静脉回输后广泛分布于骨髓、肝脏、脾、胃肠道、肾脏、肺脏及肌肉等器官组织，对受体BM-MSCs来源的检测成果发现，供体来源的MSCs能够定植于受体骨髓。Maitra等体外扩增人MSCs，与造血干细胞（HSC）共移植给NOD/SCID小鼠，对照研究成果显示，当HSC数量有限时，只有同时予以MSCs输注才干获得更为有效的造血植入。黄绍良等进行了自体和异基因MSCs联合脐血移植的I期临床实验，成果显示异基因MSCs联合UD-UCBT含有明显增进造血恢复的作用。Lazarus等对MSCs自体输注进行了I期临床实验，从23例造血系统肿瘤涉及急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病（ALL）、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤缓和期患者中分别抽取骨髓10ml-15ml，体外培养扩增MSCs，15例患者经2-3次传代后给与3个剂量组进行回输，各剂量组均未发生输注有关毒性反映。Koc等对28例晚期乳腺癌患者施行高剂量清髓性化疗，然后输注外周血动员的自体干细胞和经体外扩增的自体MSCs；全部患者也均未发生输注有关反映，并且造血功效快速恢复。Lee等联合应用HLA半相合的亲缘外周血动员干细胞及其体外扩增的MSCs移植对1例高危AML女性患者进行治疗后,该患者造血功效快速恢复,急、慢性GVHD均未发生，随访至移植后31个月时仍保持完全缓和。联合HSCs和间充质干细胞进行移植确实能够增进移植后造血功效的恢复，其移植成功率明显高于单纯的HSCT。间充质干细胞增进HSCs归巢、定植、增殖并不依赖于对骨髓造血微环境的修复，而与其产生的多个细胞因子如SDF一1、TGF一81、MIP一1a及MCP一1等有关。间充质干细胞不仅能够增进造血功效恢复、减少移植后并发症的发生率和死亡率，并且没有明显的毒副作用，提示间充质干细胞移植是一种安全、可行的办法。对移植物抗宿主病（GVHD）的防治作用：同种异基因HSCs移植是可能治愈多个恶性血液病的唯一办法，但是GVHD的发生却大大减少了移植的成功率，GVHD是引发异基因HSCT后患者死亡的重要因素之一。研究表明间充质干细胞含有克制T细胞激活、增殖的功效，能够用以GVHD的防治。研究发现，发生GVHD时患者促炎因子分泌增加，树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞被激活引发组织损伤。体外实验表明MSCs能够和多个免疫细胞互相作用，以变化其免疫功效。MSCs不仅含有免疫逃避能力，并且含有克制排斥反映的功效。MSCs能够克制幼稚性和记忆性T淋巴细胞，阻抑T淋巴细胞与抗原提呈细胞(APCs)接触，通过APCs间接的克制T淋巴细胞。尽管MSCs发挥免疫调节功效的机制尚不清晰，但其对GVHD的防治潜能是能够拟定的。MSCs含有良好的免疫耐受性，能够逃避受者的免疫识别，对T淋巴细胞的克制作用和其供者来源没有明显的关系。近来Ringden等人应用异基因间充质干细胞治疗类固醇耐药的GVHD患者疗效明显。8例病人中有6例急性GVHD完全明显，并且没有MSCs治疗的急性副反映出现。他们得出结论认为对于异基因MSCs治疗GVHD来说，无论是HLA配型相合，半相合还是完全HLA不匹配供者来源的MSCs都合用，并且能够较好的修复GVHD所致的肠道上皮损伤。因此能够选用MHC不相匹配的间充质干细胞进行移植以提高移植效率，克制GVHD。总之，联合间充质干细胞和HSCs进行移植能够提高移植效率，减少GVHD的发生率，并且是一种安全、无直接和后期毒性的治疗办法。在神经系统疾病的应用研究干细胞含有向神经细胞分化的潜能是神经科学研究的重要进展，给许多以前认为是不治之症的神经损伤性疾病(如脊髓损伤、脑损伤、外周神经损伤等)的治疗带来了新但愿。在脊髓损伤中的研究：脊髓损伤后形成瘢痕组织妨碍神经元的再生下行、神经纤维的变性坏死以及中枢神经系统内克制神经元再生的微环境等因素，妨碍了脊髓损伤的恢复。骨髓MSCs的发现、分离与成功诱导分化为神经细胞，为脊髓损伤的移植治疗提供了“种子细胞”，其移植可能成为一种保护和增进损伤的脊髓功效恢复的崭新治疗手段。Ankeny等将MSCs种植脊髓损伤的大鼠模型中，成果发现，移植组大鼠后腿空中蹬腿动作以及步态循环控制能力恢复，MSCs移植物充满病变腔隙，并随着有宿主组织和白质(髓鞘)的保存，证明含有神经保护作用；与对照组相比，移植组能更有效地增进轴索生长；另外，MSCs中的大部分神经纤维生长方向与脊髓的长轴索平行，提示其可直接纵向生长。Hofstetter等对动物损伤的脊髓模型进行MSCss脊髓内移植，1周后动物步态明显改善，移植5周后发现移植区和瘢痕组织区之问可见到新生神经纤维束穿过。以上事实阐明，植入MSCs对脊髓损伤引发的运动功效障碍有明显的疗效。在脑缺血性疾病方面的研究：现在，许多研究发现将人骨髓MSCs移植给脑缺血动物模型，能有效减少梗死体积、减少神经缺点评分，并能明显改善神经功效的恢复。给永久性大脑中动脉栓塞大鼠静脉输注人骨髓MSCs，发现MSCs能进入损伤脑区，其数量随时间增加。在大鼠皮质脑缺血后1周把纯化的人骨髓MSCs移植到损伤周边皮质区能明显改善大鼠的感觉运动功效，组织学分析移植的MSCs体现星形胶质细胞标志物(GFAP)、少突胶质细胞标志物(GalC)和神经元标志物，阐明移植的MSCs能向神经元前体细胞或神经元样细胞分化。鼠缺血脑组织的提取物培养能增进人MSCs产生神经营养因子和血管源性生长因子，提示脑缺血后的微环境变化可能与MSCs的治疗作用有关。另外，Chert等还通过静脉给大脑中动脉栓塞24h后的大鼠注射人MSCs，分析缺血边沿带的血管发生和宿主脑内的VEGF及其受体水平，发现MSCs能增进大鼠脑内血管发生，可能与人MSCs增加了内源性VEGF及其受体水平有关。Crigler等研究发现人MSCs移植后，其不同的细胞亚型体现不同的神经细胞调控分子，对宿主神经细胞的存活和神经再生起到了一定的作用。在心血管性疾病方面的应用研究据统计，我国每年死于血管性疾病的人数高达300多万，已占我国每年总死亡人数的34%-40%。由于溶栓治疗、介入治疗和外科治疗等办法治疗等办法的开展，死亡率有所下降。但现在的治疗办法并不能逆转已有的心肌病变，特别是大面积心肌梗死后心肌细胞的大量丧失。因此移植外源性细胞有望成为恢复心肌功效的新的方略。MSCs含有向心肌细胞分化的潜能，研究表明自体MSCs动员或冠脉种植对急性心肌梗死，慢性缺血及心脏移植排斥反映等都有明显改善作用。将MSCs直接移植到小鼠心脏，移植的细胞可体现肌球蛋白重链，并向心肌细胞分化。Shake等采用犬LAD结扎60min的心肌梗死模型，分离自体MSCs，心肌梗死后2周将MSCs注射到心肌梗死区，发现在全部治疗组动物心肌中都有MSCs存活，在MSCs移植后2周开始体现肌肉特异性蛋白，4周后心脏收缩功效明显改善，提示MSCs有心肌再生作用。将MSCs直接注射到梗死区或经静脉注射后，在损伤区均能见到MSCs定位，分化为心肌细胞，且心功效得到明显改善并能防止有害的重构。细胞移植是一种新型的治疗心脏疾病如心肌梗死和心衰的办法，它的良好疗效来源于移植细胞的活性分布、被动性提高心脏的机械功效、诱导血管新生、尚有对心脏生物学方面的其它作用。但移植细胞的疗效以及最佳移植部位及移植时机有待进一步研究在骨组织工程中的应用由疾病、创伤所致的骨、软骨损伤为临床上常见且难以解决的问题，现在常规的治疗办法有自体或者异体、异种骨移植，但它们都存在一定的问题和限制，难以完全满足临床需要。现在，以组织工程办法进行软骨再生的报道诸多，诸如在皮下注射软骨细胞形成小的软骨结节；运用软骨膜片将培养分离的软骨细胞固定在软骨缺损部位使软骨再生。因此，修复大面积软骨缺损的生物载体应是形状可控制的三维支架构造的体内植入物，软骨细胞在这种构造中能增殖分化，并且形成含有正常软骨成分(重要指糖胺聚糖和II型胶原)以及含有对应的生物机械特性的再生软骨。骨髓MSCs含有强大的自我扩增、自我繁殖及多向分化的能力，它的易扩增性能在很短的时间内得到足够的种子细胞，并且随着细胞的扩增，细胞的性状和分化特性并不会变化和丧失。在特定的成软骨诱导培养条件下，MSCs在体内外均可分化为软骨细胞或构建出软骨组织；Shapiro等用放射自显影办法证明当关节软骨损伤穿透软骨下骨时，损伤周边的软骨细胞并不参加组织修复，修复组织重要来源于骨髓MSCs细胞。由于骨髓MSCs细胞获得方便，MSCs的分离和纯化技术已趋成熟，现在被认为是软骨组织工程最有发展潜力的种子细胞。展望对MSCs进行基因修饰以治疗缺点性疾病是现在的研究热点。MSCs含有体外扩增培养及自我更新的能力，转入外源基因后不影响其特性，因此可成为基因治疗抱负的靶细胞。因此，能够将MSCs细胞治疗和基因治疗结合起来，通过改造的MSCs对基因缺点、基因突变所致的疾病进行治疗。即使运用MSCs进行基因治疗的前景乐观，但是在临床应用中仍有许多安全性问题需要解决，如MSCs可能定植于肿瘤组织，为肿瘤细胞的生长提供适宜的微环境；外源基因转染MSCs的效率低下；基因变异可能造成肿瘤的发生；病毒性载体的生物安全性及基因修饰MSCs在患者体内功效的检测等。现在MSCs的重要来源为成人骨髓，但成人骨髓源MSCs细胞数量及增殖分化潜能随年纪的增大而下降，病毒感染率较高，且供者MSCs的采集须行骨髓穿刺术，抽取大量骨髓（约500毫升），因此来源受到限制。研究发现，MSCs在人胎儿和生后多个组织广泛存在，涉及骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和脐血等。但是，胎儿的应用又受到道德伦理和传统观念的限制。有关脐血MSCs的报道存在较多争议，且脐血MSCs的分离会损失脐血中造血干祖细胞，影响脐血干细胞的冻存和使用。因此，寻找新的MSCs的来源成为现在国内外研究的热点。我单位率先在国际上分离并且初步鉴定证明了脐带MSCs特点，支持造血功效以及其它某些功效。我们研究发现，脐带MSCs拥有诸多骨髓MSCss的特点。在神经诱导条件下脐带MSCs比骨髓MSCs更易于向神经分化。另外脐带MSCs细胞因子谱除了体现骨髓MSCs有关细胞因子外还额外体现GM-CSF和G-CSF.这些研究成果提示脐带MSCs的开发和运用品有非常广阔的前景。在上述研究的基础上始终进行着后续研究，现在在促造血重建，免疫调节方面以及治疗血管性疾病已经获得很大进展，为其此后的临床应用奠定了坚实的理论基础和技术平台。（二）研究开发和产业内容及总体目的研究开发和产业内容1．多个组织间充质干细胞的分离，纯化和培养，以及生物学特性研究现在MSCs的重要来源为成人骨髓，但成人骨髓源MSCs细胞数量及增殖分化潜能随年纪的增大而下降，因此来源受到限制。研究发现，MSCs在人胎儿和生后多个组织广泛存在，涉及骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和脐血等，因此，寻找新的MSCs的来源成为现在国内外研究的热点。（1）骨髓、胎盘及脐带MSCs的制备：应用胶原酶和胰酶相结合的酶直接消化法，通过磁珠筛选，从胎盘和脐带中获得大量的MSCs。对比采用不同培养基培养胎盘及脐带MSCs，通过检测MSCs的增殖和分化潜能的差别，建立MSCs的最适培养办法。（2）骨髓、胎盘及脐带MSCs的生物学特性、免疫调节、支持造血等功效研究：（3）骨髓、胎盘及脐带MSCs多向诱分化；2．间充质干细胞治疗重大疾病的研究（1）治疗恶性血液病作用的研究（2）治疗血管性疾病作用的研究血管性疾病严重威胁着人类健康、影响患者生活质量，尚缺少有效的治疗方案。干细胞移植为这些血管病变和损伤的治疗带来了但愿，因此，充足运用来源丰富、取材方便的间充质干细胞的可塑性，开展对血管性疾病防治新办法的研究含有十分重要的现实意义和社会意义。重要研究内容：=1\*GB3①建立内皮祖细胞数量减少及功效缺损的动物模型,检测该模型动脉的病理学形态及功效的变化，观察与否有动脉粥样硬化的形成。筛选出增加内皮祖细胞的数量、提高其功效的因子及转染后能提高内皮祖细胞功效的基因。用这些因子解决内皮祖细胞或基因转染内皮祖细胞，然后移植到实施内膜球囊损伤术的兔体内，观察内膜的修复状况，明确提高内皮祖细胞功效能否防治动脉粥样硬化的形成。=2\*GB3②间充质干细胞局部移植治疗肢体缺血性疾病：外周血管病变模型建立：糖尿病小鼠下肢微血管病变，结扎下肢动脉致严重缺血。将MSC局部注射到病变下肢，然后通过下肢活动能力受限评分以及下肢缺血评分来评定功效恢复。PBS做对照，骨髓来源的MSC为阳性对照。运用激光多普勒血流检测局部血流恢复状况，血管造影检测局部侧支循环的形成。=3\*GB3③间充质干细胞作为基因治疗的载体，转染PDGF基因后其功效研究：通过PCR将目的基因PDGF扩增，然后酶切，连接以及重组子转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，重组腺病毒质粒的纯化，重组腺病毒的包装、获取、鉴定。重组腺病毒的扩增与纯化以及病毒梯度的测定。然后感染脐带MSC，重复感染。含CMV启动子重组腺病毒感染效率的测定：运用报告基因鉴定。PDGF转染的脐带MSC的细胞形态、细胞生长曲线、细胞增殖能力、抗凋亡能力、免疫表型与否变化及基因修饰过的MSC的多向分化能力有无变化。细胞的条件培养基收集后用Elisa办法检测分泌的因子PDFG、VEGF，bFGF等有无变化。=4\*GB3④转染PDGF基因的脐带来源的间充质干细胞局部移植防治糖尿病微血管病变：链尿菌素诱导的裸鼠，在血糖尿糖增高后1－2个月，持续观察其下肢毛细血管密度，小动脉密度和内皮细胞凋亡状况。局部移植PDGF修饰的MSC细胞，观察肢体功效恢复状况，下肢血流以及毛细血管密度等。观察肌肉组织的PDGF等细胞因子的体现。同时研究内皮细胞的凋亡状况。（3）软骨组织工程中间充质干细胞的临床前应用研究使用脐带间充质干细胞修复关节软骨,探索其体内成软骨的能力,并与骨髓间充质干细胞修复软骨缺损成果做比较性研究,旨在为软骨修复开辟新的途径。本实验用人脐带间充质干细胞为种子细胞,用同种异体骨髓间充质干细胞移植作为阳性对照组、缺损不解决作为阴性对照组,以糖胺聚糖和II型胶原或聚乳酸(PLA)为支架,移植修复兔全层关节软骨缺损,通过对体内修复组织及滑膜的检测,拟定脐带间充质干细胞对软骨缺损的修复作用及免疫反映。重要研究内容:=1\*GB3①脐带MSCs体外定向分化为软骨细胞及鉴定选择最佳诱导培养基、诱导因子和增殖因子、诱导培养时间，研究脐带MSCs向软骨细胞分化的条件。=2\*GB3②脐带MSCs和诱导软骨细胞与支架材料复合培养研究支架材料聚乳酸(PLA)对诱导软骨细胞增殖能力、粘附能力和免疫学功效等生物特性的研究。=3\*GB3③诱导软骨细胞增进全层关节软骨缺损修复的动物实验研究使用脐带MSCs以及软骨诱导后的细胞，以糖胺聚糖和II型胶原或聚乳酸(PLA)为支架，移植修复兔全层关节软骨缺损，通过对体内修复组织及滑膜的检测，并与兔骨髓MSCs修复软骨缺损成果做比较，拟定脐带MSCs以及软骨诱导后的细胞对软骨缺损的修复作用及免疫反映。探索比较它们体内修复软骨的能力。（4）IL-27基因修饰的间充质干细胞治疗本身免疫病的临床前研究间充质干细胞在细胞治疗和基因治疗方面含有不可无视的优势，以间充质干细胞为载体的基因治疗将成为将来研究的热点。IL-27是近来发现的最重要的含有克制炎症免疫作用的细胞因子。基于间充质干细胞和IL-27的抗炎作用在临床上的广泛应用前景，我们将两者结合起来：建立高体现IL-27的间充质干细胞系，盼望其对本身免疫病提供新的治疗方略。研究内容（1）高体现IL-27的MSC治疗胶原诱导的关节炎（CIA）：建立小鼠的关节炎模型，将MSC或高体现IL-27的MSC注入关节炎部位或小鼠腹腔内，观察其治疗作用。比较治疗组和对照组小鼠关节病变处的病理变化，免疫细胞构成，以及多个细胞因子的体现状况。（2））高体现IL-27的MSC治疗实验性本身免疫性脑脊髓炎（EAE）：建立小鼠的EAE模型，将MSC或高体现IL-27的MSC注入小鼠脑内的病变部位，观察小鼠的生存期。脑内病变部位的细胞因子的体现，各免疫细胞所占的比例和功效状态，脑部组织病理变化状况。（3）高体现IL-27的MSC治疗本身免疫性肝炎：建立本身免疫性肝炎模型。将MSC或高体现IL-27的MSC从尾静脉注入小鼠体内。观察小鼠的生存期，肠子的病变状况，病理变化，肠道和脾脏细胞因子的体现状况和各免疫细胞亚型的构成状况。（4）高体现IL-27的MSC和造血干细胞共移植治疗再生障碍性贫血：建立小鼠的再障模型，对其进行allo-BMT的同时，尾静脉输注MSC或高体现IL-27的MSC。观察对再障的治疗效果，并观察小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)后移植物抗宿主病(GVHD)的发生率和生存率的变化。流式细胞仪检测受鼠各T细胞亚群的差别，检测细胞因子的分泌状况和及骨髓的病理学变化。3．间充质干细胞应用中安全性研究脐带间充质干细胞临床应用，属于同种异体的细胞移植，我们对培养后的间充质干细胞进行致瘤性、全身性毒性等方面进行安全性评价。研究内容（1）体外致瘤实验：软琼脂培养法是体外检测转化细胞和肿瘤细胞致瘤性最为惯用的办法，与细胞的恶性程度有很大的符合率。普通肿瘤细胞在这样的培养条件下1－3周可见克隆形成，在表层琼脂内成桑椹状。用光学显微镜观察，可见克隆内的细胞呈圆形，透亮，排列成团。普通认为由16个细胞以上构成的细胞团为一种克隆，克隆内的细胞数目随着培养时间增加而增多。如果细胞成颗粒状，细胞轮廓不清晰，阐明细胞已经死亡。如果持续培养2周仍未见克隆形成，则考虑接种的细胞没有肿瘤细胞的特性，间接反映这种细胞的移植后无致瘤性。（2）体内致瘤性实验：将细胞制剂接种到动物体上，观察其成瘤性，由于裸鼠含有下列特点：先天性胸腺缺点，胸腺依赖性免疫功效缺少，T细胞功效靠近于零，但B细胞功效大致正常，异种移植时无排斥反映。因此裸鼠普通作为接种的动物。接种的办法能够是局部皮下接种或尾静脉注射，接种后持续观察1个月，根据肉眼观察和病理切片观察与否有肿瘤形成来反映检测的细胞群体与否含有致瘤性。肿瘤细胞局部接种后约1个月左右（最短在3天）可见注射的局部有肿瘤出现，甚至有转移瘤（普通在肺部）形成。经病理组织学检查能够拟定肿瘤与否由接种的细胞产生。肿瘤细胞经静脉注射，在移植后1月左右可在不同的组织器官内观察到肿瘤形成。经病理组织学检查能够拟定肿瘤与否由接种的细胞产生。（3）全身脏器急、慢性毒性实验研究，重要通过在NOD/SCID小鼠中注射相称于临床病人用量100倍的脐带原始间充质干细胞，在急性实验中持续观察一周实验动物的体重，活动，饮食，与否腹泻，生存状况。慢性毒性实验重要观察细胞移植6个月后与否对造血，肝肾功效造成慢性损害，观察指标重要为血常规，生化指标及处死后各重要脏器的病理学检查，通过这些指标综合判断间充质干细胞与否存在严重的毒性作用。总体目的预期可获得的成果、知识产权和人才培养状况:建立起间充质干细胞产品、技术和资源平台、脐带间充质干细胞库，建立完整的生产和质量控制体系；明确间充质干细胞在治疗血液系统恶性疾病、心血管疾病、神经系统疾病以及软骨组织工程中的作用以及机制；明确间充质干细胞治疗疾病的安全性；初步制订上述几个疾病的临床实验方案，向国家食品药品监督管理局申请Ⅰ期临床研究；申请专利项；发表SCI文章篇；脐带间充质干细胞获得SFDA或者卫生行政主管部门对应的临床批文；培养博士后名，博士生名，硕士生名。（三）实施条件优秀的学科带头人、成熟和完善的系列技术、国际水平先进的实验室和配套设备为支撑：课题的承当单位不仅含有学科优势，有一支年富力强的、构造合理的优秀研究队伍，课题负责人在所属领域的工作均获得了国外同行的高度评价和承认。并且在细胞信号传导、细胞移植和基因治疗的核心实验技术和实验室及配套的仪器设备方面也有着明显的优势，如在活细胞显微分析、干细胞定向诱导分化和扩增、细胞移植治疗以及基因治疗等技术领域已经含有国际先进水平的