生物工程-氨基酸取代对螺旋型抗菌肽活性的影响

目录TOC\o"1-3"\u第一章前言 第一章前言自然存在着多种病原微生物，严重威胁着人类的身体健康和生存，而抵抗病原微生物的常用方法是使用抗生素类药物。在上世纪40年代，世界上第一种抗生素首次被科学家发现，后被投入医药界，用于医治疾病和改善人们的健康水平，至今已经有将近80多年的历史了。抗生素的问世，极大地改善了人们的生活质量和健康水平。但“自古成败皆一人”，由于全球人类在生活生产各方面对抗生素的滥用，导致细菌的耐药性逐渐增强，而且很难有效将其消灭，不断涌现出各种耐药菌比如耐药性肠杆菌、结核杆菌和超级耐药菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等，这些不断涌现且很难消灭的耐药菌使得细菌感染性疾病再次成为困扰人们的难题。据《柳叶刀》杂志报道，近期在英美印度等国家小规模爆发的细菌感染性疾病由一种新型的耐药性超级细菌NDM—1引发，现今存在的抗生素对其无效。现在有越来越多的细菌、病毒出现了对药品和抗生素的抗药性，导致这些旧时的医药和抗生素对这些细菌和病毒已经不能起到很好的杀灭和抑制作用。在加上对这些细菌和病毒来讲，杀灭和抑制作用很强的药品、抗生素的开发和研制进程缓慢，因此寻求一种对病毒和细菌杀灭抑制作用强并且高效广谱、无残留、无耐药性、低副作用的抗生素替代品，成为近年来人们一直努力的目标。1.1抗菌肽综述抗菌肽是一类来自于生物本身免疫系统的防御分子，具有抵御外源分子侵害、特异性识别清除体内病变细胞的功能。上世纪70年代，Bakula和Hink等科学家通过精心研究发现了能对细菌起到很好的杀灭和抑制作用的物质，他们首次从大蜡螟(Galleriamellonella)和黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的血淋巴细跑中提取到了这种物质。之后于1974年，瑞典科学家Boman等通过向眉纹天蚕蛾蛹注入大肠埃希菌，然后在血淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱类多肽物质，而且极低浓度的提取物在5分钟之内即能杀死103—104数量级的E.coli。随后在古比天蚕蛹中也发现了类似的抗菌活性物质，1981年，这种具有抗菌活性的物质被正式命名为cecropin（抗菌肽）。抗菌肽广泛分布在包括哺乳动物，植物，鸟类，两栖动物，鱼类，昆虫和微生物在内的几乎所有物种。抗菌肽是非常有效的，并在天然免疫系统中发挥关键作用，包括细菌，病毒，寄生虫，真菌甚至癌细胞等病原体。到目前为止，已发现超过2400个抗菌肽，并且166个肽已经表现出抗癌活性。相比于传统抗生素，抗生素拥有受热不易分解、广谱性、在水中有较好的溶解度、对细菌和病毒的杀灭和抑制作用强等优点，可以说是一种拥有很大的研究和实际价值的物质。抗菌肽的构造分为一级构造和二级构造，二者结构差异很大。一级构造从某种程度上来说具有一定的保守性，在它的N端和C端分别含有对谁比较亲和的Arg和Lys氨基酸残基，它们PH呈碱性。而相比一级结构，二级结构呈圆环形，有的还延伸堆叠成一定的片状结构，二级结构在空间在具有一定的规律性，大多呈现出α-螺旋结构，β-折叠，这两种结构对水脂都是比较亲和的。抗菌肽通常表现出以下性质：①富含碱性氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸，这使得多肽在中性pH中表现出+2至+9的净正电荷；②它们通常由5-40个氨基酸残基组成，疏水残基的百分比大于30％；③通常具有两亲性，在疏水环境中同时具有极性和非极性表面的构象。1.2抗菌肽作用机理与阳离子抗菌肽相比之前研制和发现的抗生素药物在体内作用于某些固定的靶蛋白，具有一定的定向性。而阳离子抗菌肽在体内的作用机理确完全不同，它直接做用于细胞膜，它通过接触、吸附、粘结在细胞上，并释放某些可以使细胞膜发生裂解的物质，最后导师细胞细胞膜破裂，而失去活力。虽然抗菌肽的具体作用机制还不太清楚，但是目前来说，在生物界和学术界普遍被认同的学说有如下四种假说：去垢剂的细胞膜溶解模式、桶板模式、地毯模式和虫孔模式。①地毯模式：在这个假说中。抗菌肽就像一块毛毯，均匀排列在细胞膜上，将细胞紧紧遮盖，抗菌肽与构成细胞膜的磷脂双分子中的头部相互接触，当与细胞膜接触的抗菌肽足够多时，细胞膜收压会逐渐弯曲失稳，这样就破坏了细胞膜的原生结构，会使细胞膜恶化，导致细胞失去活性，细胞内的有机质就会流出。②桶板模式：抗菌肽利用静电吸引作用结合于细菌细胞膜表面并发生聚合，这样会导致细胞膜的结构产生改变，并且抗菌肽会以多聚体的形式从垂直细胞膜的方向贯穿到构成细胞膜的磷脂双分子中。多肽分子疏水面朝通道外部，亲水面朝通道内部，从而形成横跨细胞膜的离子通道。③虫孔模式：抗菌肽平铺在细胞膜上，抗菌肽的亲水基会与细胞膜中的亲水部分接触，即与细胞膜的磷脂双分子接触，而疏水基会进入细胞膜内，与细胞膜内的疏水部分接触，当细胞膜所接触的抗菌肽逐渐增多时，细胞膜的心态就会发生改变，细胞膜会在抗菌肽的作用下形态拉伸变长，当细胞膜的心态继续变长时，就会形成虫孔式通道。④去垢剂模式：顾名思义，多肽起到了除垢剂的作用，当细胞膜与逐渐多的多肽接触时，多肽的亲水基和疏水基就会将磷脂双分子破坏，使其变成一段一段的胶态离子，这样就会破坏细胞膜的结构，使得细胞变性失活，最后使得宿主结构找到破坏。1.3本文的研究目的和策略如前所述，许多抗菌肽都具有富含正电性的精氨酸和赖氨酸，而许多穿膜肽则富含精氨酸，为了对比研究精氨酸和赖氨酸对抗菌肽的抗菌活性、溶血毒性以及与细菌内膜和外膜的相互作用能力的影响，在本研究中，我们以前期工作的抗菌肽HPRP-A1为模板，通过利用精氨酸取代原始的赖氨酸，设计合成了三条含有不同精氨酸数量的抗菌肽，并对其活性进行研究分析。

第二章抗菌肽的设计、合成以及活性表征第一节实验试剂与仪器1.1实验试剂及来源HBTU吉尔生化有限公司（上海）N,N—二甲基甲酰胺吉尔生化有限公司（上海）HOBT吉尔生化有限公司（上海）异丙醇北京化工厂二氯甲烷北京化工厂二甲苯北京化工厂甲醇北京化工厂无水乙醇北京化工厂苯酚中国惠世生化试剂有限公司（上海）水合茚三酮中国惠世生化试剂有限公司（上海）六氢吡啶（哌啶）郑州万博化工产品有限公司乙酸酐郑州万博化工产品有限公司RinkamideMBHA树脂天津南开合成科技有限公司NPN（1-N-phenyl-naphtylamine）Sigma-Aldrich公司，棕色瓶4℃储存邻硝基苯β-D-半乳糖苷中国科学院上海生化所溶液A：5g水合茚三酮，100ml乙醇溶液B：80g熔融苯酚，20ml乙醇剪切液：哌啶:DMF=1:4（体积比）1.2实验仪器设备通风橱SONLAB大连诚誉实验设备有限公司气浴恒温振荡器THZ—92B上海博远实业有限公司循环水式多用真空泵SHB—ⅢA上海豫康科教仪器设备有限公司电子天平HZK—210温州华智科学仪器有限公司恒温培养器GL—150北京维欣仪奥科技发展有限公司冷冻干燥机FD—1D—50北京博医康公司分析型高效液相色谱LC—20A日本岛津公司制备型高效液相色谱LC—6A日本岛津公司CO2培养箱MCO—15AC日本三洋公司紫外分光光度计UV-2550日本岛津公司荧光分光光度计RF-5301PC日本岛津公司

第二节多肽合成、纯化与表征2.1多肽合成本实验采用多肽合成的方法是固相合成，原理是首先将固相树脂载体上的化学基团和氨基酸的羧基末端连接，通过固体树脂载体上的化学基团与氨基酸的羧基末端相连接，暴露氨基端连接肽，接着利用一定的方法处理需要连接的氨基酸，保护其氨基端和侧链基团，暴露与活化其羧基端，进而同固相树脂的氨基端进行连接反应。通过使肽链氨基端脱保护，连接一个氨基酸，再使氨基端脱保护，再连接下一个氨基酸，通过重复以上过程，就可以得到所需要的肽链。具体实验方法：A.树脂的浸泡活化称取250mg(0.2mmol)RinkamideMBHAresin加入合成管中，浸泡在3ml的DCM溶液中B.树脂FMOC保护基脱保护1.采用真空泵减压设施抽滤除掉DCM2.加入事先提取的8ml含哌啶20%的DMF剪切溶液3.25℃恒温振荡器中放置30分钟，之后利用真空泵减压设施抽滤除掉剪切溶液4.用3mlDCM、异丙醇、DMF逐次清洗两遍C.氨基酸连接1.氨基酸的活化：于1.6（1.2）ml0.45MHBTU,1.6(1.2)ml0.35MHOBT,220（165）ulDIEA(0.742g/ml)中分别加入事先装备的0.8(0.6)mmolL-Fmoc-AA，充分混合，使其均匀。之后进行活化。（括号内为配置的1：3的氨基酸）2.提取活化的氨基酸于合成管中，再加入3mlH氨基酸，1.5ml二甲苯，6mlDCM，其作用是为使得树脂悬浮。25度气浴恒温振荡器摇3-5h（H氨基酸反应6h.）。多肽连接到十个氨基酸后可以过夜反应，不需要过夜的反应树脂用5mlDMF浸泡保护。3.真空泵减压抽滤除去反应溶液4.依次用约3mlDMF、异丙醇、DCM洗两遍D．茚三酮法检测取微量树脂于1.5mlEP管中，之后依次加入50ulA,B，使其混合均均后，在100C的恒温培养器中放置5分钟，观察培养基中液体的额颜色。弱颜色为明亮的大黄颜色，则证明反应结束了，如果是其他颜色，则证明反应没有彻底完成，需要重复上面的步骤来使其进行反应彻底。E.氨基酸FMOC保护基脱保护1.按照DMF：哌啶=4：1的比例提取8ml含哌啶20%的DMF剪切溶液2.在25℃恒温振荡器中放置30分钟，之后利用真空泵减压设施抽滤除掉剪切溶液3.用浓度3ml的DCM、异丙醇、DMF依次清洗两遍F.茚三酮法检测取微量树脂于1.5mlEP管中，之后依次加入50ulA,B液，使其混合均均后，在100C的恒温培养器中放置5分钟，观察培养基中液体的额颜色。弱颜色为紫蓝色，就证明了氨基酸脱保护成功。（若脱保护未成功，则需要重复E-F步骤，直到成功。）G．按照C到F过程，继续连接下一个氨基酸。H．乙酰化1.按照DMF：哌啶=4：1的比例提取8ml含哌啶20%的DMF剪切溶液。带无哦呦氨基酸已全部连接，25℃恒温振荡器中放置30分钟，之后利用真空泵减压设施抽滤除掉剪切溶液2.用3mlDCM、异丙醇、DMF逐次清洗两遍3.加入1.0ml（1000ul）DCM和4mlDMF4.按照每0.2mmol树脂加500ul(AcO)2O和800ulDIEA的标准，逐次加入(AcO)2O和DIEA，之后再25℃恒温振荡器中放置30分钟5.浓度为3ml的DCM冲洗三遍，每次冲洗时长为2min，之后重复D过程（茚三酮检测）6.待检测结束后，用3mlDCM、DMF、DCM,MeOH,DCM逐次清洗7.真空泵减压设施抽滤除掉剪切溶液I.多肽剪切1.向多肽合成管中加入TFA（90％）、TIS（5％）、水（5％），混合均匀，室温条件下放入气浴恒温振荡器震荡2小时2.无水乙醚放入-20℃冰箱预冷，将剪切液滴入预冷的无水乙醚中3.再次向多肽合成管中加入5％TIS和水、90％TFA，充分混合使其均匀，然后放置在25℃的恒温振荡器中放置1h。4.将剪切液滴入预冷的无水乙醚中，使其逐渐沉淀，分层，待分层后利用真空泵除去上清液。5.将沉淀溶解在50％的乙腈水溶液中，在低温浴槽结冻成冰状6.在冻干机内的真空环境干燥多肽，将提取的粗制的多肽密封保存在零下20摄氏度的环境中。2.2多肽纯化合成完毕的粗肽经过反相高效液相色谱进行提纯。在分离提纯前，我们需要将粗制的多肽略取少许制成浓度为1mg/ml的溶液，用RP-HPLC进行分析色谱分析，通过监测其在色谱中保留时间的长短，据此设置不同的梯度来进行洗脱。之后配置溶液A是含0.1％三氟乙酸的水，溶液B是含0.1％三氟乙酸的乙腈，A、B两种溶液是用来洗脱的，在用之前必须用0.22µm的滤膜过滤而且再进行超声脱气才可使用。接下来，我们用纯净水将冻干的多肽充分溶解，之后在10000rpm中离心5min，把上清液通过0.22µm的滤膜就行过滤。将过滤后的上清液在Zorbax300SB-C8柱子(实际大小6.5µm，孔径为300Å，AgilentTechnologies，规格为250×9.4mmI.D.)进行实验，程序是之前设定好的，流速为2毫升/分钟。经过以上的分离提纯步骤，我们能得到纯度至少95％以上的多肽。纯化后得到的多肽样品经电喷雾质谱和氨基酸组成分析进行定量确认后，进行生物活性测定。2.3多肽表征本实验需要合成的抗菌肽：HPRP-A1Ac-FKKLKKLFSKLWNWK-amideHPRP-A1-2RAc-FRKLKKLFSKLWNWR-amideHPRP-A1-4RAc-FRKLKRLFSRLWNWR-amideHPRP-A1-6RAc-FRRLRRLFSRLWNWR-amide图1：HPRP-A1-2R质谱图图2：HPRP-A1-2R色谱图图3：HPRP-A1-4R质谱图图4：HPRP-A1-4R色谱图图5：HPRP-A1-6R质谱图图6：HPRP-A1-6R色谱图图7：HPRP-A1色谱图HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R分别是二、四、六个精氨酸取代原始肽链中赖氨酸合成得到的多肽，图1--图6是其质谱图和色谱图，将以上结果总结得到以下表格。理论分子量/g.mol-1实际分子量/g.mol-1保留时间/min纯度/℃HPRP-A11697HPRP-A1-2R20912091.041796HPRP-A1-4R21472146.7217.596HPRP-A1-6R22032202.9118.596

第三节MICMHC法检测抗菌肽活性表征实验中共利用了四种细菌，两种革兰氏阳性菌，金黄色葡萄球菌（S.aereus）和枯草芽孢杆菌(B.aubtilis)；两种革兰氏阴性菌，绿脓杆菌(P.aerugino)和大肠杆菌(E.coli)。使用了四种抗菌肽，HPRP-A1、HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R。3.1抗菌活性测定a.细菌复苏：利用灭菌的接种环蘸取菌液在LB固体培养基划线，37℃，过夜培养b.细菌培养：挑取单克隆菌种接种至LB液体培养基，37℃摇床培养16hc.样品稀释：将准备好的多肽溶解在PBS中，按照2倍梯度加水稀释，共稀释成8个浓度梯度。d.加样：将稀释后的多肽加入96孔板中，每孔10µl。e.菌液稀释：将菌液稀释成浓度5×105个/ml，用排枪加入到U型96孔板中，每孔90µl。f.37℃震荡24小时，静置10min，肉眼观察，澄清孔者为多肽抑制了细菌的生长，临界于浑浊孔的澄清孔为多肽的最低抑菌浓度。3.2溶血活性测定a.样品稀释：将准备好的多肽溶解在PBS中，按照2倍梯度加水稀释，共稀释成8个浓度梯度。b.加样：将稀释后的多肽加入96孔板中（96孔板需事先加入红细胞），每孔10µlc.用EDTA抗凝管抽取2~3毫升人血，要混合均匀，之后置于4℃的环境中保存。d.在提取的2ml血液中加入事先配置好的PBS缓冲液2-3ml，之后再1000rpm中离心5分钟。重复上步骤两次，之后配置新的PBS，此时加入PBS缓冲液的量为40ml，此时血细胞浓度为2×108个/ml。e.按照以下设定加U型96孔板实验组：红细胞悬液以70µl+多肽溶液70µl/孔空白对照：140µlPBS/孔；阴性组：（70µl红细胞悬液+70µlPBS）/孔；阳性组：取2ml红细胞悬液，离心，弃去PBS，加入2ml纯水，细胞破裂混匀，70µl红细胞裂解液+70µl水/孔f.在37摄氏度下，87rpm的环境中孵育振荡2小时，之后3000rpm离心5min。吸取90μl上清液体至平底96孔板中，监测578nm处吸光值。g.满足（OD实验-OD阴性）/(阳性-阴性)大于0.1条件的第一个浓度为MHC。3.3结果分析peptideMIC(µM)MHC(µM)P.aeruginoB.aubtilisE.coliS.aereusHPRP-A116881664HPRP-A1-2R32483264HPRP-A1-4R644161632HPRP-A1-6R6483232323.3.1MIC实验结果分析绿脓杆菌(P.aerugino)，由表格数据可以看出，四种抗菌肽对其的MIC数值都比较大，表明四种抗菌肽对绿脓杆菌的杀伤能力比较差。经查阅文献可得，绿脓杆菌属于革兰氏阴性菌，有荚膜，对于化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强大，青霉素对其无效，所以四种抗菌肽对其抑菌能力不强是可以理解的。而经众多研究表明，绿脓杆菌的耐药机理有四种：①产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶；②抑制降低了药物穿透细胞壁的渗透力，从而减少了到达作用靶点药物的浓度；③改变抗菌药物作用靶点的位置，从而逃避抗菌作用；④细菌本身的膜屏障与主动外排作用，从而限制药物到达作用靶位。枯草芽孢杆菌(B.aubtilis)，根据表格数据可知四种抗菌肽对其的灭杀能力相当强，可以在很低浓度下造成很大的杀伤力。经文献查阅发现枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，无荚膜，这可能是枯草芽孢杆菌对抗菌肽抗性很低的原因。从数据整体来看，母肽HPRP-A1对四种菌的杀伤能力都位列前排，说明母肽的抗菌活性是最强的。而对于改造后的抗菌肽可能针对某些菌株杀伤能力较强，例如抗菌肽HPRP-A1-2R针对枯草芽孢杆菌(B.aubtilis)，抗菌肽HPRP-A1-4R针对枯草芽孢杆菌(B.aubtilis)与金黄色葡萄球菌（S.aereus），但是抗菌肽HPRP-A1-6R对四种菌株的杀伤性都不是很强。3.3.2MHC结果分析MHC表示多肽对正常红细胞的毒性，数值越大，毒性越小，所以根据数值来看，抗菌肽HPRP-A1、HPRP-A1-2R相对HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R毒性低。3.3.3综合分析根据MIC、MHC两项实验的结果综合分析讨论，母肽HPRP-A1具有优良的抗菌活性，对于各类细菌均具有强大的灭杀能力，并且对正常红细胞的毒性小。但是随着多肽链中赖氨酸被精氨酸逐渐取代，抗菌肽对各类细菌的杀伤力变得降低，而且对正常红细胞的毒性升高，所以赖氨酸相对于精氨酸具有更好的抗菌活性和更低的细胞毒性。

第三章抗菌肽穿膜能力研究第一节ONPG内膜穿透实验1.1原理当细菌在有乳糖存在的环境中就会从自身细胞质中产生一种可使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的水解酶——β-半乳糖苷酶。一种乳糖的类似物ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）目前已经被发现能很快地进入细胞内。根据β-半乳糖苷酶将ONPG分解成黄色的邻-硝基苯酚和半乳糖，因此可从培养液的颜色来判断是否有β-半乳糖苷酶存在。对大肠杆菌细胞来讲，邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷进去他的细胞还需要乳糖透性酶的帮助，因此这段时间内β-半乳糖苷酶的活性就会降低。当细胞膜的机构找到破坏时，细胞的通透性就会降低，此时ONPG能快速进去细胞内，OD值快速升高。因此。可通过监测β-半乳糖苷酶活性来判断抗菌肽对细胞通透造成的影响。1.2过程实验菌种：大肠杆菌E.coliML-35ATCC43827培养基：含5％乳糖的LB液体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，乳糖50g,加入双蒸水950ml，调节pH达到7.4后用双蒸水定容至1000ml）细菌处理：利用含有5%乳糖的LB培养基培养大肠杆菌，收集细菌，用无菌水重悬，使其OD420nm=1.2。将1000μl细菌悬液与100µl30mM邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG)混合，然后加入16μg/ml的抗菌肽HPRP-A1、HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R900μl,阴性对照组加入0.5%NaCl，使用紫外分光光度计连续检测90min（设定波长为OD420nm）。1.3结果根据图可以看出，抗菌肽HPRP-A1所达到的最高值明显高于其他抗菌肽和阴性，由此可以得到抗菌肽HPRP-A1对大肠杆菌细胞内膜的穿透性很彻底，使得OD420nm值达到最高。然后再来看每条图线的斜率，抗菌肽HPRP-A1的图线斜率最大，达到顶峰所用的时间最短，这表明抗菌肽HPRP-A1对大肠杆菌细胞的破环最迅速，其对大肠杆菌的杀灭能力最强。从图的整体看，根据折线最高点和斜率对四个抗菌肽的灭菌能力进行排序：HPRP-A1>HPRP-A1-2R>HPRP-A1-4R>HPRP-A1-6R。

第二节NPN外膜穿透实验2.1原理NPN是一种疏水性荧光探针，当处在亲水环境中它的荧光效果就会减弱。当革兰氏阴性菌整体完整时，外膜的疏水分子不会暴露出来，然而一旦外膜被穿透，磷脂暴露，疏水荧光探针NPN就与外膜磷脂层结合发出荧光，因此可用荧光分光光度计发出的荧光强度来判断细胞膜是否破坏以及破坏程度。2.2过程实验菌种：大肠杆菌E.coliML-35ATCC43827培养基：LB除盐培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，加入双蒸水950ml，调节pH达到7.4后用双蒸水定容至1000ml）细菌处理：将大肠杆菌接种于20ml液体LB培养基中，37℃摇床培养18小时；然后取1ml菌液接种到50ml的LB液体培养基，37℃摇床培养至OD600nm=0.4~0.6。4000g(RCF)×10分钟离心后收集菌体，利用Buffer（pH7.4,4.5mMHEPES,5mMNaN3）重悬至OD600nm=0.5。取300µl抗菌肽HPRP-A1、HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R溶液加入到2.7ml菌液中，阴性对照组加入相同体积Buffer（pH7.4,4.5mMHEPES,5mMNaN3），抗菌肽的浓度设立三个对照组，分别200µm/ml、400µm/ml、800µm/ml。设定激发波长为使用荧光分光光度计连续检测10min，激发波长设定为OD350nm，发射波长为OD420nm。2.3结果图是200µm/ml抗菌肽NPN外膜穿透实验利用荧光分光光度计检测进行数据处理后得到的结果。根据图像中不同颜色图线的最高点进行分析，得到结论：母肽HPRP-A1和改造后的抗菌肽HPRP-A1-2R同时达到相同高度，表示在200µm/ml抗菌肽浓度之下，母肽HPRP-A1和改造后的抗菌肽HPRP-A1-2R对大肠杆菌的外膜穿透能力相差不大，而其他抗菌肽HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R对大肠杆菌的外膜杀伤能力略差。而且母肽HPRP-A1和改造后的抗菌肽HPRP-A1-2R在0.5分钟就达到最高值，表明杀伤大肠杆菌的速度快，效率高。针对200µm/ml抗菌肽为NPN外膜穿透能力进行排序：HPRP-A1=HPRP-A1-2R>HPRP-A1-4R>HPRP-A1-6R。图为400µm/ml抗菌肽NPN外膜穿透实验利用荧光分光光度计检测进行数据处理后得