槐米中芦丁和槲皮素含量测定方法的研究进展

槐米中芦丁和槲皮素含量测定方法的研究进展

蝗虫大米中最有效的活性物质是黄酮类化合物，如甘蔗和木维素。芦丁具有广泛的药理活性,能维持及恢复毛细管的正常弹性,增强其抵抗力,防止血细胞凝聚,临床用于防治脑溢血、高血压等心脑血管疾病;槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒等多方面的药理作用。我国是芦丁的出口国,槐米是提取芦丁的主要原料,2005版《中华人民共和国药典》(一部)规定,槐米中总黄酮的含量(以无水芦丁计)不低于20%,无水芦丁(C27H30O16)不少于15%。因此,研究槐米中芦丁和槲皮素含量测定方法对槐米质量控制有很重要的意义。现将槐米中芦丁和槲皮素的含量测定方法综述如下。1分光光度法1.1芦丁、槲皮素含量测定及其分配的回归方程李氏等用等吸收紫外光度法同时测定槐米中的芦丁和槲皮素。分别配制槲皮素和芦丁的单组分标准溶液,测定它们在波长240~380nm的吸光度,经过粗选和细选,分别找出槲皮素和芦丁的等吸收波长λ1247、λ2266、λ3340、λ4370。然后分别配制一系列浓度的芦丁、槲皮素溶液,测定其在波长247nm和266nm、波长340nm和370nm处的吸光度,计算其对应的吸光度差值,分别作出ΔA-C校准曲线及线性回归方程。用上述方法测定槐米中芦丁和槲皮素的含量。将槐米的乙醇提取物配制成一系列不同浓度的甲醇溶液,在波长247nm和266nm、340nm和370nm下分别测定其吸光度值,并计算吸光度差值,据回归方程计算芦丁和槲皮素的浓度。然后分别计算样品中芦丁和槲皮素的含量,6个样品中芦丁平均含量为80.60%,RSD=1.61%;槲皮素平均含量为9.49%,RSD=1.53%。1.2工作曲线的绘制和测定利用铝与槲皮素形成荧光配合物,姚氏等采用荧光光度法测定槲皮素。文献中选择测定条件为激发波长365nm,发射波长498nm,测定温度为室温,溶液酸度控制为pH=6,选用2×102mol/L铝标准溶液。在10mL比色管中,加入一定量的槲皮素标准溶液,再加入三氯化铝标准液1mL,用95%乙醇稀释至刻度,振摇均匀后放置15min,用1cm比色皿,在960型荧光光度计上测其荧光强度,同时做空白试验,绘制工作曲线。将槐米乙醇提取物用蒸馏水溶解,过聚酰胺柱,待水解液过完后,再用蒸馏水洗柱3次,用95%乙醇洗柱,洗至醇洗液加三氯化铝无荧光反应。合并乙醇洗液,测其中样品的含量。方法加标回收率97.8%~100.0%,RSD=2.58%(n=6)。1.3非催化体系活性物质的合成在盐酸介质中,微量芦丁对重铬酸钾氧化靛红的反应有明显的催化作用,崔氏等建立了测定芦丁的催化动力学光度法。取2只10mL具塞刻度试管,其中一只加入一定量的芦丁标准液,另一只不加,再分别依次加入0.60mL0.10%靛红溶液、0.90mL0.30mol/L盐酸溶液、1.10mL0.010mol/LK2Cr2O7溶液,然后加水至刻度,摇匀,反应10min后,以水为参比,用1cm比色皿于611nm波长处测量非催化体系的吸光度A0和催化体系的吸光度A并计算ΔA。将槐米乙醇提取液按实验方法进行测定,同时做标准加入回收实验。方法的线性范围是0.003~0.09µg/mL和0.10~100µg/mL,检出限为0.003µg/mL,回收率为95.5%~102.5%(n=4)。1.4样品前处理与测定李氏等采用固相萃取-分光光度法联用来测定中药槐米中芦丁含量。准确配制不同浓度的芦丁标准溶液,用移液管准确量取溶液置于100mL量瓶中,加甲醇至5mL体积,加0.30mL5%NaN02溶液,放置6min;再加0.30mL10%Al(NO3)3溶液,放置6min;再加4.00mL4%NaOH溶液,最后加甲醇至刻度,摇匀。室温放置15min后,在紫外分光光度计上于λ=500nm处测定吸光度,处理数据得回归方程。样品测试:先用5mL石油醚洗柱,再用5mL甲醇洗柱,最后加水5mL洗柱;加槐米甲醇提取溶液上柱,每2mL为单位收集流出液。UV测定:以第7~8mL流出液测试并进行数据处理得原药材样品中芦丁的含量为29.1%。将标准品溶液及原药材样品液定量混合后依上法进行分析,平均回收率为99.98%,RSD=0.012%(n=3)。1.5模拟样品测定和回收率王氏等采用卡尔曼滤波光度法同时测定槐米中芦丁和槲皮素含量。准确配制芦丁、槲皮素甲醇标准溶液2个系列(每个系列3~5个)溶液。取上述系列标准溶液,在230~300nm范围内,每间隔2nm测其吸光度,数据进行线性回归处理,求出各自的吸光系数。取芦丁、槲皮素浓度一定的模拟样品分别测定5次,计算RSD分别为2.54%和1.54%。取已知含量的模拟样品6个,加入芦丁、槲皮素适量,测定其含量,方法的平均回收率分别为:芦丁99.1%(n=6,RSD=1.58%),槲皮素99.2%(n=6,RSD=1.98%)。槐米提取物中芦丁和槲皮素的测定:准确称取一定量样品,用甲醇提取后,以上述方法测得芦丁含量为82.32%,RSD=0.45%,槲皮素含量为9.59%,RSD=1.2%(n=3)。1.6标准曲线和检出限张氏等利用在稀硫酸介质中,微量芦丁对高碘酸钾氧化玫瑰桃红R褪色反应有明显的阻抑作用,据此建立了测定微量芦丁的动力学光度法。取2支10mL具塞刻度试管,分别加入0、0.4mL芦丁标准溶液,再分别依次加入3mol/LH2SO41.0mL、0.5g/L玫瑰桃红R溶液1.0mL、0.01mol/L的KIO4溶液0.7mL,加水稀释至刻度,混匀。在(94±0.1)℃恒温水浴加热反应4min后,迅速启开管塞用流水冷却4min,以水为参比,用1cm吸收皿在分光光度计上于521nm波长处测量褪色体系的吸光度A0和阻抑褪色体系的吸光度A,计算ΔA=A-A0的值。分别移取不同量芦丁标准溶液置于一批10mL具塞刻度试管中,按实验方法操作,根据所得结果绘制工作曲线,芦丁质量浓度在0.02~0.4µg/mL范围内与ΔA呈线性关系,得线性回归方程;对空白溶液进行11次平行实验测定,按3倍标准偏差计算出检出限为5.0×10-9g/mL。将槐米乙醇提取液按实验方法进行测定,同时做标准加入回收实验,回收率95.5%,RSD=2.8%(n=4)。1.7荧光强度法检测傅氏等采用薄层色谱-化学衍生荧光分光光度法测定槐米中芦丁的含量。实验方法是以95%乙醇为溶剂进行索氏提取,用醋酸乙酯-甲酸-水(4∶1∶1)为展开剂分离,洗脱后以10%AlCl3甲醇溶液作为反应试剂,在激发波长420nm、发射波长513nm处测定荧光强度。结果此方法的线性范围为0.2~1.2µg/mL,平均回收率为98.7%,RSD=2.71%,利用外标两点法计算样品中芦丁的含量。测定5份槐米市售样品中芦丁的含量,得槐米原药材中芦丁的含量为21.33%,RSD%=3.78%。2液体层析成像法2.1外标法提取芦丁邓氏等用高效液相色谱法来检测槐米中芦丁的含量。色谱条件:分析柱为Nova-PakC18柱(150mm×4.6mm),流动相为甲醇-水(35∶65,v/v),应用前经0.45µm的过滤膜,超声脱气,流速为1.0mL/min,AUFS0.05,进样量为10µL,柱温为30℃,检测波长为261nm。槐米用乙醇提取,以外标法定量,测得槐米中芦丁的含量为22.67%,平均回收率>96.32%(n=5)。此法对芦丁的最低检测浓度为0.5µg/mL,最低检测限(10µL)5ng。2005年版《中华人民共和国药典》中芦丁的测定方法采用高效液相色谱法。色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:甲醇-1%冰醋酸(32∶68);检测波长:257nm;进样量10µL,理论塔板数不低于2000。样品用甲醇超声提取,甲醇定容,干燥槐米中芦丁含量不得少于15.0%。2.2样品含量测定程氏等采用反相高效液相色谱法来测定。色谱柱:HP-HEWLETTODS(125mm×3.0mm,3µm)反相柱;流动相:乙腈-四氢呋喃-0.2%枸椽酸溶液(14∶1∶85);流速:0.4mL/min;检测波长:360nm;柱温:30℃;进样量:5µL。用标准加入法测得芦丁、槲皮素平均回收率分别为99.75%(RSD=0.57%)和99.42%(RSD=1.19%,n=5)。槐米用甲醇超声提取,测得槐米样品中芦丁含量24.46%,RSD=0.18%,槲皮素含量1.41%,RSD=2.0%(n=3)。朱氏等测定了槐米中槲皮素的含量。采用的色谱条件:Shim-PackCLC-ODS(150mm×6.0mm,5µm)色谱柱;室温;流动相:甲醇-水(用乙酸调pH值为3.3)为55∶45(V/V);流速:1.0mL/min;检测波长370nm;进样量20µL。槐米用甲醇提取,根据标准曲线得粗制品中槲皮素平均含量为812.0µg/mg,得精制品中槲皮素平均含量为908.0µg/mg,槐米中槲皮素的含量为59.8mg/g。平均回收率99.98%±2.71%,RSD=2.71%(n=4)。使用与文献一样的色谱柱,徐氏等测定了槐米中槲皮素的含量。色谱条件:流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(7∶3);流速为0.8mL/min;检测波长为375nm;柱温为30℃;进样量为5µL。该方法的线性范围为10.03~100.3ng,r=0.9997;平均回收率为99.06%,RSD=2.07%(n=9)。槐米用甲醇盐酸回流提取,测定分析了4批样品中槲皮素的含量分别为12.62%(RSD=0.66%)、9.66%(RSD=1.07%)、9.13%(RSD=O.74%)、11.19%(RSD=O.42%)(n=3)。2.3工作电位周氏等探讨了毛细管电泳法测定槐米中槲皮素和芦丁的含量。背景缓冲液为30mmol/L硼砂溶液(pH=9.0),3000Pa压力下进样30ms,分析电压20kV,254nm检测,温度25℃。将干燥的槐米微波萃取后,测得槐米中槲皮素含量3.0mg/g(RSD=2.1%,n=5),芦丁含量211.0mg/g(RSD=1.6%,n=5)。张氏等自制微型碳糊电极,采用高效毛细管电泳-安培检测法对芦丁水解常数进行了研究,并用于芦丁和槲皮素的检测。在恒温杯中注入芦丁溶液;另将装有盐酸溶液的容量瓶同时置于恒温槽中。15min后,迅速将盐酸溶液倾入恒温杯中并加以搅拌,同时记录时间。然后每隔相应的时间,移取1.0mL上述水解混合液,迅速加入9.0mL20mmol/L磷酸钠(pH=8.0)溶液,冷却,以终止水解反应,并记录水解时间。电泳分离条件:电泳液的酸度为pH=8.0的磷酸盐缓冲液(20mmol/L),分离电压为15V,电动进样时间为10s。末端检测,工作电位+1000mV,检测限分别为0.6mg/L和2.0mg/L,平均回收率97.6%。陈氏等使用自组装的毛细管电泳-电化学检测(CE-ED)装置,电化学检测池为三电极体系:碳圆盘电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝为辅助电极。通过三维定位调节器使工作电极与毛细管出口在一条直线上,并尽可能靠近毛细管末端。采用电动进样,条件为在12kV下从毛细管阳极端进样6s,检测池为阴极电泳槽。100mmol/L硼酸盐缓冲液(pH9.0)为运行缓冲液。在槐米样品溶液中准确加入芦丁和槲皮素的标准溶液,5次测得平均回收率为97.89%(芦丁)和96.83%(槲皮素),RSD分别为2.06%和2.42%。李氏等自组装CE-ED,同样使用电化学检测方法,用Ag/AgCl做参比电极,铂丝为辅助电极。扫描时间2min,电压-0.5~1.5V,工作电位100mV,测定时间3min。电泳测定的最佳条件:测定电位1.2V,分离电压12kV,15kV下进样5s,缓冲液为20mmol/L含40mmol/LSDS和10%乙腈的硼酸盐溶液(pH=8.8)。芦丁和槲皮素的最低检测下限分别为0.001mg/mL和0.0005mg/mL,样品中两物质含量分别为3.63%和2.59%。QingcuiChu等的电泳条件及检测方法与文献基本一致。样品处理:分别称取大约2g生槐米和炒制槐米,研碎后精密称取,然后用10mL无水乙醇-水(4∶1)混合溶液超声提取30min,过滤后测定。芦丁和槲皮素的检测下限分别为2.0×10-7、2.8×10-7g/mL,RSD分别为2.3%、2.2%。3供试品的测定王氏用薄层扫描法来测定槐米中芦丁含量。自制薄层板(硅胶G-硼酸-枸橼酸=100∶0.9∶0.3;用0.3%CMC-Na水溶液湿法铺板;10cm×20cm,厚0.5mm),展开剂为乙酸乙酯-丁酮-正丁醇-甲酸-水(10∶6∶1∶2∶2),检测波长为360nm,单波长锯齿扫描,狭缝0.2mm×0.3mm,Sx=5。槐米用甲醇提取,外标两点法测定供试品中芦丁的平均含量,为25.75%,RSD=1.05%(n=3)。平均加样回收率为98.52%,RSD=1.76%(n=5)。4电压法4.1还原波的测定马氏等采用单扫示波极谱法测定槐米中芦丁含量。pH=3.5的0.1mol/LNaAc-HAc溶液为底液,分别取不同量的1.0mol/L芦丁标准溶液于10mL容量瓶中,加支持电解液至刻度,摇匀。在JP3-1型示波极谱仪上单扫记录二阶导数还原波。扫描电位:-1.10~-1.60V。样品中芦丁的测定:槐米加乙醇回流提取后,然后将提取液于10mL电解杯中,加入10mLpH=3.5的0.1mol/LNaAc-HAc溶液,用单扫示波极谱法测定。结果槐米中芦丁含量为21.41%±0.16%(n=6),RSD=0.74%。4.2玻璃电极的制备Jing-LinHe等测定原理基于β-环糊精对芦丁的作用,采用β-环糊精膜电极为工作电极,用循环伏安法测定了槐米中芦丁的含量。膜电极的制作:将2mg的多壁碳纳米管(MWNT)和1mLβ-环糊精混合,超声搅拌,得2mg/mL的黑色悬浮物;将玻璃电极刨光后,分别用蒸溜水和乙醇超声清洗2次,然后将6µL上述悬浮物滴到玻璃电极上,在室温下,空气中干燥24h。测定方法:将电极插入含芦丁的0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH3.0)中搅拌4min,工作电位+0.8~0.1V,扫描速度20mV/s,检测下限为2.0×10-7mol/L。5测试方法陈氏等H-point法在灰色体系中的应用,利用标准加入系列光谱数据测定了槐米中芦丁的含量。扫描区间200~450nm,速度为10nm/min,狭缝宽度为2nm。测定方法:精密量取不同体积的芦丁标准溶液,分别置于25mL不同量瓶中,加入样品1.0mL,并加水至刻度,摇匀,在200~450nm扫描