酵母双杂交系统衍生体系研究进展

酵母双杂交系统衍生体系研究进展

蛋白质与蛋白质之间的相互作用是维持生命活动的最基本条件。因此研究蛋白质之间的相互作用自然成为生命科学基础研究的重中之重。传统的研究蛋白质之间相互作用的方法效率低、敏感度差,而且反映的只是蛋白质在体外作用,已无法满足大量、快速筛选结合蛋白的需要。1989年由StanleyFields等提出并建立了一种新的直接于细胞内检测蛋白—蛋白之间相互作用且敏感性、特异性很高的遗传学新方法,即酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。其最突出的特点是能够在酵母这种繁殖迅速、遗传背景清楚且操作简便的体系中研究真核细胞的蛋白质之间的相互作用,并通过cDNA文库的筛选可以直接找到与未知蛋白质相互作用的DNA序列。1在转录和转录作用上的应用真核生物中存在一种上游激活序列(UAS),可在转录水平进行基因表达调控,其作用是和激活蛋白结合并大大增加启动子的转录速度。酵母转录因子GAL4可分为结构上可分开的、功能上相互独立的两个结构域;即N端1-174位氨基酸区段的DNA结合域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸区段的转录激活域(Activationdomain,AD)。DNA-BD可识别位于GAL4效应基因(GAL-responsivegene)的上游激活序列,并与之结合。而AD则是通过同转录过程中其它成份之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录。BD与AD分别作用并不能激活转录反应,但二者在空间上较为接近时,则呈现出完整的GAL4转录因子活性,并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录。将DNA-BD与已知的诱饵蛋白X融合,构建BD-X质粒载体;将AD基因与cDNA文库中基因片段或基因突变体Y融合,构建AD-Y载体。将其共转化至酵母体内表达,该酵母株含有特定的报告基因(LacZ,HIS3,LEU2等),并已经去除相应转录因子的编码基因,因此本身并无报告基因转录活性。如果融合蛋白X和蛋白Y之间存在相互作用,则导致BD与AD在空间上的接近,从而激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达,使转化体由于HIS3或LEU2表达而可在特定的缺陷培养基上生长,同时因LacZ表达而在X-gal存在下显蓝色。如果融合蛋白X和蛋白Y之间没有相互作用,报告基因的转录则不能被激活(图1)。许多DNA激活蛋白包括原核激活蛋白的DNA-BD均可被用于酵母双杂交系统,最常用的是GAL4和LexA蛋白的DNA-BD,而最常用的AD是GAL4、HSV的VP16和E.coliB42等蛋白的AD。报告基因包括操纵子或DNA-BD能够识别并结合的DNA序列如UAS。通常任何能在酵母中表达的基因均可作为报告基因,较为常用的是LacZ,更为有效的是一些营养缺陷标记,这种报告基因只允许阳性克隆生长,最常用的是His3和Leu2。近来为了更灵敏、特异地筛选阳性克隆,国外学者使用两种或两种以上的报告基因(如ADE2和URA3等)。2酵母同双杂交系统传统的研究蛋白质之间相互作用的方法很多,如交联、修饰、免疫共沉淀和亲合层析等,而且都是采用体外实验来研究蛋白与蛋白间的相互作用。因此在研究中往往受到许多外界实验条件、环境和方法的影响,而且对所研究蛋白的浓度和纯度要求很高,这样就导致了许多假阳性和假阴性实验结果。另外无法准确研究蛋白之间微弱的相互作用。酵母双杂交系统则是采用体内实验来研究蛋白之间的相互作用,使研究方法发生了革命性的改变,它不受外界影响,方法精确,易于操作。更具特色的是所有操作均是在核酸水平上进行,无需纯化大量的蛋白,并可精确地测定蛋白质之间弱相互作用。归纳起来有以下优点:(1)酵母是真核细胞,可以对表达的融合蛋白进行一些基本的修饰(如糖基化和磷酸化等),表达的蛋白可在细胞核中产生交互作用。(2)酵母转化方法操作简单,转化率高,转化率可稳定在106个转化子/μgDNA以上。(3)酵母能同时容纳两种质粒,而且质粒的提取也较方便。(4)酵母菌有很多的营养缺陷型标记,筛选比较方便,能够比较容易地获得所期望的阳性克隆,从cDNA文库和基因组文库中直接筛选出蛋白质间的相互作用成为它最具优势之处。尽管如此,酵母双杂交系统也有其自身的一些问题和缺陷。首先,它并非对所有的蛋白质适用,因为融合蛋白的相互作用激活报告基因是在细胞核内发生的,所以表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并被运至核内是检测蛋白之间有否相互作用的前提条件。因而不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作用就不易使用该系统。尽管目前已在表达质粒中加入了核定位序列,但仍不能完全解决这类问题。同时由于酵母的后加工系统与哺乳动物细胞的后加工系统不尽相同,某些哺乳动物细胞的蛋白需经过翻译后加工才能相互作用,对这类蛋白质该系统也不适用。其次,假阳性的发生频率较高,其中部分原因还不清楚,可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。再次,大量表达的外源基因可能具有毒性作用,从而影响菌株的生长和报告基因的表型;为抑制背景表达而在培养基中加入的3-AT(3-Aminotriazole)等物质也对菌株有一定的毒性,使得一些较弱的蛋白质间的相互作用呈假阴性结果。另外,双杂交系统虽可筛选出大量的相互作用,但其中部分蛋白质可能处于不同生长发育时期、不同细胞空间或不同的细胞类型中,在正常生理状态下是不可能相互作用的,所以对于筛选对象和范围需有一个明确的界定。3蛋白质组织化学应用随着酵母双杂交系统的不断完善发展,它已广泛应用于分子生物学的各个领域,其主要用途集中于以下6个方面。(1)寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白质,该系统最为重要的用途就是从cDNA文库中发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白质。目前已利用该系统对HBV、HCV和HIV等多种病毒蛋白基因的相互作用蛋白进行了研究。(2)敏感、特异地检测已知蛋白质间的相互作用,寻找及确定蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域。(3)确定蛋白质之间弱的相互作用。(4)确定基因治疗中多肽类药物的作用机理。(5)利用双杂交系统进行药物筛选,在这个领域中,反向双杂交技术的应用更为广泛。(6)利用酵母双杂交系统建立蛋白相互作用图谱,即大规模双杂交技术在蛋白质组学中的应用。2000年初,Walhout等以线虫的生殖发育过程为研究对象,从已知的27个线虫发育相关蛋白出发,构建了一个大规模的酵母双杂交系统,并得到了100多个相互作用结果。4酵母双杂交系统vidal随着酵母双杂交系统应用的不断深入,该系统及与之相关的技术也不断得到发展和完善。为了提高双杂交系统的特异性,国外学者在以下几个方面对双杂交系统本身进行了改进。(1)通过利用酵母着丝粒载体(它在细胞中含有较低的拷贝数)及利用缺失的启动子(如ADHI)来降低两个杂交蛋白的表达水平,来降低假阳性的发生。(2)通过增加不同的报告基因(ADE2、HIS3和LacZ等)排除假阳性。(3)针对一些蛋白可能存在毒性,选用更加灵敏的报告基因,如采用LexA酵母双杂交系统(LexA取代GAL4的BD,单纯疱疹病毒的VP编码区88个氨基酸取代了GAL4的AD区段)。(4)在能够再增殖的条件下,引入酵母交配策略来筛选大量的不同诱饵蛋白。为解决大量的非核内蛋白质如膜受体蛋白、细胞外分泌蛋白等在该系统中的应用,Aronheim对传统的系统做了重大改进,构建了SOS恢复系统,将蛋白质的相互作用场所从核内转移到酵母的细胞膜上进行。其原理为:利用酵母温度敏感株、ras途径突变体由于缺乏鸟苷酸交换因子(GEF)cdc25-2,而不能将外来信号传递给膜上的Ras蛋白,致使该酸母突变体在36℃不能存活,如人为地引入正常的GEF(SOS蛋白),并使得GEF与Ras蛋白足够接近,则可弥补这一缺陷。将GEF与蛋白质X融合,将蛋白质Y与豆蔻酰化信号相连,使Y定位于膜上。这样X若与Y结合,X连同的蛋白(EGF)就会定位于膜上,从而得以靠近膜上的Ras蛋白,激活Ras途径,完成SOS过程,在36℃生长。为解决蛋白质的翻译后修饰等方面的问题,近来构建了哺乳动物细胞双杂交系统。其优点是解决了酵母细胞不能对一些特定蛋白的翻译后修饰的问题,其不足是不能大量筛选转化子。另外,国外学者为了拓宽传统的酵母双杂交的应用范围,在完善该系统的同时创立了许多基于双杂交原理的新系统。目前应用较为成功的主要有,单杂交系统(One-hybridsystem)、三杂交系统(Three-hybridsystem)和逆向双杂交系统(ReverseTwo-hybridsystem)等。酵母单杂交系统主要用于研究蛋白质与DNA间的相互作用,这一过程无需BD-X的参与。酵母三杂交系统是研究两个蛋白质与第三个成分间的相互作用,按照第三个成分的不同,可以是蛋白质RNA或小分子药物,如果是蛋白则与双杂交的候选条件相同;如果是RNA,则需构建成可以转录成待研究RNA的质粒;如果是小分子药物,可以用化学方法进行修饰。然后使这三种成分相互作用,通过观察下游报告基因的转录情况,判断这三者间是否存在相互作用。根据研究成分的不同可分为:蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小配体三杂交系统和RNA杂交系统。反向双杂交体系的核心在于构建一种反向筛选的报告基因,即蛋白质间特异相互作用所激活的报告基因表达能阻碍转化体生长,从而发挥蛋白质间解离的选择环境。Vidal以毒性标志URA3为报告基因,BD-X和AD-Y的相互作用使毒性标志基因表达,对野生型酶母产生毒性或致死性作用。在此情况下,解离BD-X和AD-Y的作用有助于酵母菌的生长。URA3的表达产物为酵母细胞合成尿嘧啶所必需,同时可催化5-