蔗糖酶米氏常数的测定

蔗糖酶米氏常数的测定

酶反应动力学是生物化学和物理反应动力学的重要组成部分。酶催化反应机理与均相(多相)催化反应机理有显著差别,通过实验比较两类反应动力学行为的差异,对学生掌握化学反应动力学基本理论和方法非常有益。蔗糖转化反应实验是经典的化学反应动力学实验之一。该反应可以用酸均相催化完成,也可以用蔗糖酶催化完成。在实验教学中,前者常采用测定溶液旋光度的方法,连续测定反应的动力学曲线,是典型的物理化学实验方法;后者则采用化学淬灭法终止反应,取样分析获得初始反应速率值,是典型的生物化学实验方法。由于实验方法的差异性,学生在进行这两类实验时很难相互比较,无法将两者有机联系起来,因而不能完整理解和掌握化学反应动力学的相关理论。1米氏方程的基本理论本文研究开发了一种新的蔗糖酶催化蔗糖转化反应的实验体系,采用与均相酸催化蔗糖转化反应完全相同的实验技术和实验方法,连续测量蔗糖溶液在蔗糖酶催化作用下的旋光度的变化,通过数据拟合推算反应的初始速率,然后用米氏方程求算相关酶促反应参数。根据化学反应动力学理论,酶催化反应机理是Michaelis和Menten应用酶反应过程中形成中间络合物的学说导出的米氏方程。蔗糖酶(E)与底物蔗糖(S)先形成中间化合物(ES),然后中间化合物再进一步分解为产物葡萄糖(G)和果糖(F),并释放出酶(E)。机理如下:当反应温度和酶的总浓度确定时,酶促反应速率可以表示为式中KM为米氏常数,rm为最大速率,该方程称为米氏方程。采用旋光度法测定反应体系中蔗糖浓度时,反应体系的旋光度与蔗糖浓度的关系为式中αt为反应t时刻反应体系的旋光度,α0为反应初始时刻反应体系的旋光度,α∞为完全反应时反应体系的旋光度,为蔗糖的初始浓度。积分后得到从原理上说,按上式直接拟合实验测定的t-θ数据就可以得到酶促反应参数KM和rm。但是,由于实验数据的不完备性、波动性以及酶制剂的质量问题,t-θ关系式中的拟合参数可能无法与上式中相关项的定义一一对应。一般地,可以把实验测定的t-θ关系表达为如下的普遍形式:经过数据拟合,可以得到拟合参数A、B,并计算出蔗糖初始浓度为时的初始反应速率为实验时,配制一系列不同初始浓度的蔗糖溶液,并测得其α0和α∞。在相同实验温度和酶浓度条件下,分别测定每个溶液的反应时间t和旋光度αt数据,并计算出θ值。拟合t-θ关系得到拟合参数A、B,并计算每个溶液的初始反应速率r0,由此得到一系列数据,代入米氏方程中。根据Hanes-Woolf作图法,米氏方程可以变形为用对作图得一直线,直线斜率为1/rm、截距为KM/rm,由此求得米氏常数KM和最大速率rm值。该实验方法简便、实用,物理化学概念清晰明了,实验技术也是学生熟练掌握的旋光度测定法,实验数据与酸催化蔗糖转化反应的实验结果对照性很强,有助于学生通过对比更好地理解掌握酶催化反应的特点和规律。2实验2.1碘量瓶ml电子天平、恒温水浴、锥形瓶(100mL)、移液管(5mL、10mL、25mL)、pH计、离心机、离心管、超级恒温槽、旋光仪、旋光管(带夹套)、玻璃漏斗、定性滤纸、烘箱、鲜酵母、蔗糖(A.R.)、果糖(A.R.)、葡萄糖(A.R.)、醋酸钠(A.R.)、甲苯(A.R.)、醋酸(A.R.)、具塞碘量瓶(100mL)、2.2蔗糖酶的最适用量(1)蔗糖酶的制取:取鲜酵母20g于100mL三角瓶中,加入1.6g醋酸钠,搅拌15~20min后使团块液化,再加3mL甲苯,混和后摇动10min,放在恒温水浴中37℃保温60h左右;取出后加入3.2mL、4mol/dm3的醋酸和100mL水,使pH值在4.5左右;将混合物以3000r/min的速度离心30min,离心后形成3层,取中层的黄色液体;再以同样速度离心30min,所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品;将此蔗糖酶用pH=4.6的缓冲溶液稀释10倍,过滤后冷冻保存。(2)蔗糖溶液初始旋光度(α0)标准曲线测定:准确称取51.3g蔗糖溶液,溶解于250mL容量瓶中,得到0.6mol/dm3的蔗糖溶液,分别用蒸馏水稀释配制0.04~0.3mol/dm3的蔗糖溶液于50mL容量瓶中,分别在35℃下恒温10min后测定各溶液的初始旋光度α0。(3)蔗糖完全分解后体系终止旋光度(α∞)标准曲线测定:用葡萄糖和果糖按摩尔比为1∶1配制0.04~0.3mol/dm3的蔗糖水解最终模拟产物,分别在35℃下恒温10min后测定各体系终止旋光度α∞;分别将浓度与得到的旋光度α0、α∞列表并作图,然后拟合得到初始浓度与旋光度以及反应完全后浓度与最终旋光度的拟合方程。(4)蔗糖酶催化过程中不同蔗糖浓度体系的旋光度变化值测定:取0.6mol/dm3的蔗糖25mL溶液于50mL容量瓶中,再加入22mL、pH=4.6的缓冲溶液,加入10mL自制粗蔗糖酶,再稀释至刻度线,得到蔗糖浓度为0.3mol/dm3的蔗糖酶催化反应溶液;移入带夹套旋光管,在35℃恒温条件下测定溶液旋光度随时间t的变化αt;然后采用同样的方法,分别取0.6mol/dm3的蔗糖溶液12.5mL、10mL、7mL、5mL和4mL,配制得到浓度为0.048~0.15mol/dm3的蔗糖酶蔗糖反应液,并分别测定其αt。2.3蔗糖初始浓度的测定(1)蔗糖溶液浓度cs与α0、α∞关系。采用蔗糖配制一系列标准溶液,并测定其旋光度α0;采用葡萄糖与果糖配制成1∶1的一系列标准浓度,并测定其旋光度α∞,并将浓度与对应的旋光度作图,得到直线的线性很好结果,如图1所示。(2)在35℃恒温下测定0.3mol/dm3的蔗糖溶液在蔗糖酶作用下,溶液的αt~t的关系数据。以θ为横坐标,t为纵坐标作图,用Origin软件按方程(6)作非线性拟合,得到拟合参数A、B值(见图2)。按同样方法作图计算得到一系列不同蔗糖初始浓度对应的A、B值,并列于表1中。按方程(7)计算每个对应的初始反应速率r0值。将上述数据采用式(8)拟合直线,直线斜率为1/rm,在纵轴上截距为KM/rm,直线延伸于横轴交点为-KM(见图3)。实验测得35℃时本实验使用的粗制蔗糖酶的米氏常数KM=0.029mol/dm3,最大速率rm=1.30×10-4mol/(dm3·s),与文献值相符。3实验体系的优越性本实验采用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应体系中溶液的旋光度进行连续测定,使用的实验仪器与方法同酸催化蔗糖转化反应实验类似,有利于学生将传统物理化学实验与生物化学实验的概念、方法和技术进行对比,加深对酶催化反应特点的认识。本实验适用于粗制蔗糖酶作为催化剂的酶催化反应动力学研究,所采用的数据处理方法能够有效消除干扰因素(如:酶制剂不纯等)对实验结果的影响,使用常规的物理化学仪器,用比较严密的实验方法获得酶催化反应的初始反应速率数据,比较正确地描述了酶催化反应动力学方程,并得到了与文献报道相近的动力学参数。本实验方法简便、准确