生物分离技术的现状与发展趋势

生物分离技术的现状与发展趋势

生物技术是本世纪末和下世纪初经济发展的一项重要技术之一。生物技术的发展为人们提供了丰富而广泛的生物产品。多数生物技术产品的生产过程是由菌体选育—菌体培养(发酵)—预处理—浓缩—产物捕集—纯化—精制等单元组成。习惯上将菌体培养以前部分称为“上游过程”,与之相应的后续过程就称之为“下游过程”或“生化分离和纯化过程”。如所周知,生物技术要走向产业化,上下游过程必须兼容、协调,以使全过程能优化进行。与上游过程相比,下游处理过程是一个多步骤、高能耗、低效率的过程,由于历史的原因,生物技术发展初期,绝大多数的投资是在上游过程的开发,而下游处理过程的研究投入要比上游过程少得多,因而使得下游处理过程的研究明显落后,已成为生物技术整体优化的瓶颈,严重地制约了生物技术工业的发展。因此,当务之急是要充实和强化下游处理过程的研究,以期有更多的积累和突破,使下游处理过程尽快达到和适应上游过程的技术水平和要求。1生物分离技术的发展“难度大、成本高”,这是包括美国MIT著名教授DanielI.C.Wang在内的,活跃在生物工程领域里的专家对生物分离技术现状的评价。生物技术产品一般具有多样性、易变性和复杂性,因此生物物质的分离除了要达到化学物质分离的纯度和经济性指标外,还要满足构象、异质性和稳定性等要求,特别要防止生物产品的失活。这样对分离技术和分离过程提出了更高的要求,使得原本就落后的下游过程处理技术更增添了几分难度。目前文献中出现的各种生物分离技术和生物分离过程,除了传统的沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法外,还有超滤、反渗透、电渗析、凝胶电泳、离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、等电聚焦、区带离心分离、凝胶萃取、超临界萃取、逆胶束萃取、双水相分配技术等。在这些分离方法和技术中,尤以逆胶束萃取、双水相分配技术以及涉及亲和机理的分离技术等引人注目,但是大多数处于实验室研究阶段,真正的实用还有不少问题有待解决。2单元分离技术从发展趋势来看,生化分离技术研究的目的是要缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率,以前的那种零敲碎打的做法,既费时、费力,效果又不明显,跟不上发展的步伐。现在对整个生物分离过程的研究要有一个质的转变,国内外许多专家和研究者认同了这种转变,并认为可以从两个方面着手,其一,继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术;其二,进行各种分离技术的高效集成化。目前出现的一些新型单元分离技术,如亲和法、双水相分配技术、逆胶束法、液膜法、各类高效层析法等,就是方向一的研究结果,而作为方向二的高效集成化,目前研究比较热门的是将双水相分配技术与亲和法结合而形成的效率更高、选择性更强的双水相亲和分配组合技术;将亲和色谱及膜分离结合的亲和膜分离技术;可以将离心的处理量、超滤的浓缩效能及层析的纯化能力合而为一的扩张床吸附技术等。过程集成(ProcessIntegration)是一般化学加工过程的重要研究方向,生物分离过程的高效集成化目前国际上尚无明确的定义,但根据国内外期刊上的报导,是否可以认为,生物分离过程的高效集成化技术的含义在于利用已有的和新近开发的生化分离技术,将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成),或者把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术,达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。按上述定义,生物分离过程的高效集成化技术包括生化分离技术的集成化和生物分离过程的集成化两方面的内容,这种只需一种技术就达到完成后处理过程中几步或全部操作的方法,高度体现了过程集成化的优势。2.1聚-半乳糖苷酶的分离纯化亲和法是生物分离中一种重要的方法,其优点是分离步骤少、专一性高,但它的致命弱点是处理液要先经过过滤等一系列前处理,而双水相分配技术处理量大,可以直接处理液固混合物,但它的专一性较差,如将双水相分配技术与亲和法结合起来,即在组成相系统的聚合物PEG(聚乙二醇)或Dextran(葡聚糖)上接一定的亲和配基,就可形成处理量大、效率更高、选择性更强的双水相亲和分配组合技术。根据配基性质不同,可有三种类型的亲和双水相系统:基团亲和配基型、染料亲和配基型和生物亲和配基型。近几年来双水相亲和分配组合技术发展极为迅速,仅在PEG上接上亲和配基就达十多种,分离纯化的物质已有几十种,如Kroner利用染料PEG和Dextran组成的亲和双水相系统分离葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶,葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶的分配系数可由非亲和双水相系统中的0.18～0.73提高到193。Ulrich利用磷酸酯PEG-磷酸盐亲和双水相系统萃取β-干扰素,β-干扰素的分配系数可由非亲和双水相系统的1左右提高到630。双水相亲和沉淀技术利用甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(Eudriget)具有在碱性条件下形成沉淀和在酸性条件下重新溶解的特性,以及该共聚物具有较好的选择性吸附性能,将共聚物吸附与双水相分配技术组合起来。将甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物溶于发酵液中,调溶液的pH至碱性,使共聚物沉淀下来并同时把目的产物吸附于共聚物中,然后将共聚物沉淀从溶液中分离出来放入由PEG/盐组成的双水相体系中,调溶液的pH至酸性,使共聚物沉淀重新溶解、使吸附的目的产物进入双水相体系中的上相。这种共聚物吸附与双水相萃取的组合技术可以达到高效率高选择性的分离。例如纯化蛋白质A时用人免疫球蛋白为配体,先将此配基固定在Eudriget上,而Eudriget在PEG/PES(聚羟丙基淀粉),双水相系统中主要分配在上相,这样因配体和蛋白质A的专一络合反应,将蛋白质A也集中在上相,调节pH值,使Eudriget沉淀,再用洗涤剂冲洗而得到目的产物蛋白质A。80年代以来,用双水相系统进行生物转化已有不少报道,意味着分离和反应的耦合。最近两年来,又出现了其它过程的耦合,例如使分离、破碎和释放过程复合在一起,而称为分离、纯化过程的高效化和节能化。已研究的实例有:β-半乳糖苷酶是来自大肠杆菌的胞内酶,可在双水相系统中使其游离释放,并同时进行分离;还可在双水相系统中间歇破碎大肠杆菌,乃使β-半乳糖苷酶的释放产生、分离与破碎复合在一起等。这些新的动向不仅大大扩展了双水相萃取的应用范畴,也为缩短基因产品分离流程,为节约能量和提高产率创造条件。2.2解离洗脱剂回收处理亲和膜分离技术是将亲和色谱与膜分离技术结合起来的一项新型分离技术。它把亲和配体结合在分离膜上,利用膜作基质,对其进行改性,在膜的内外表面活化并耦合上配基,再按吸附、清洗、洗脱、再生的步骤对生物产品进行分离,当目标蛋白质通过时,就留在膜上,而杂质则通过膜而离去,再用解离洗脱剂洗下目标蛋白质,然后把解离剂从膜上除去,得以使配基再生,重复进行再分离目标蛋白。该技术颇有潜力,可以把澄清、浓缩和纯化步骤集于一体,也可与生物反应器相组合,构成反应-分离新流程。亲和膜分离技术不仅利用了生物分子的识别功能,可以分离低浓度的生物产品,而且由于膜的渗透通量大,能在纯化的同时实现浓缩,并有操作方便、设备简单、便于大规模生产的特点。目前亲和膜分离技术已用于单抗、多抗、胰蛋白酶抑制剂的分离以及抗原、抗体、重组蛋白、血清白蛋白、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、干扰素等的纯化。下表列出了亲和膜分离技术应用的一些实例。亲和膜分离技术作为新的分离技术正在兴起和发展,相信在不久的将来它会成为生物大分子物质的分离和纯化的有力工具。2.3阳离子型的扩张床n-fm和阴离子交换层析分离葡萄糖-6-磷酸脱氢酶扩张床(expandedbed)是吸附剂处于稳定状态的流化床。与串通的填充床层析不同的是在扩张床吸附操作中吸附剂(或层析剂)层在原料液的流动下可产生适当程度的膨胀,其膨胀度取决于吸附剂的密度、流体速度。当吸附剂的沉降速度流体向上的流速相等时,扩张床达到平衡。由于吸附剂的扩张,吸附剂之间的空隙率增大,可以使原料液中的细胞、细胞碎片等固体颗粒顺利通过扩张床而被排除,同时原料液中的目标物质则被吸附在吸附剂上,这样就实现了直接从含菌体、细胞碎片或组织萃取物的发酵液中直接分离目标蛋白质的目标。扩张床的操作可分为平衡、吸附、冲洗、洗脱和复性清洗等五个步骤,如下图所示。它将料液的澄清、浓缩和初步纯化集成于一个单元操作中,减少了操作步骤,降低了分离过程的复杂程度,提高了分离效率和产品的收率,已引起人们的广泛兴趣。国外有关扩张床应用的报道从1993年以来层出不穷,而国内关于扩张床的应用报道几乎为空白。BarnfieldFrej用阳离子交换剂,应用扩张床技术从大肠杆菌破碎液里提取复性后的重组人白介素质,一步得率为97%,纯化倍数为4.35倍。Johansson等用扩张床技术从大肠杆菌周质中提取重组铜绿单胞外毒素A,处理4.5kg细胞仅用2.5h,外毒素A的比活为0.06mg毒素/mg蛋白,回收率为79%,而传统的填充床层析处理相同量的细胞则需8～10h,是扩张床的3倍,虽然比活要稍高一些(0.1mg毒素/mg蛋白),但回收率要比扩张床的低(仅为73%)。美国Genetech公司用扩张床技术从CHO细胞培养液中大规模提取单克隆抗体,一次可处理7324L未澄清的培养液,可全部除去细胞,抗体浓缩了5倍,回收率高达99%。Chang和Chase,分别用含阴离子配基DEAE和染料配基ProcionRedH-E7B的吸附剂分离葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。因染料对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶有亲和效应,所以它的纯化倍数比DEAE的要高8.6倍。Noda等用扩张床从毕赤酵母(P.pastroris)培养液中大规模提取重组人血清白,扩张床柱内径为1000mm,内装150LSTREAMLINESP,一次可以处理2000L酵母培养液,总收率(87.1%)与中试时得到的结果一致。采用热处理和扩张床吸附两步操作,可以替代传统的五步操作,不仅减少了操作时间,而且产率提高了30%。Maurizi等用STREAMLINESP扩张床层析和阴离子交换层析(MonoQ)两个步骤取代了包括离心、过滤、阳离子交换层析(SSepharose)和阴离子交换层析(MonoQ)四个步骤,从枯草芽孢杆菌发酵液中提取重组人白介素1受体拮抗体(IL-lra)。使产物纯度为90%～92%,回收率达85%。这些有说服力的事例为扩张床技术在生物领域中的应用开创了一条宽阔的道路。3亲和膜色谱技术的应用目前已有研究者在采用集成化技术,如Steven等从1yme病中采用过程集成化技术大规模分离纯化重组NSI-OspA疫苗,规模从处理50L发酵液扩大到200L发酵液,而将原分离纯化的12步集成化缩短到8步,收率可从35%提高到75%。又如Cheng-kangLee等用双水相分配技术与亲和膜色谱技术集成化提纯天冬酰氨酶,比活可达27.3u/mg,纯度增加了32倍,收率也高达72%。总之,有关生物分离技术或过程的高效集成化研究目前还是很肤浅的,还不能与传统技术及过程的有效比较,尚未被大规模应用;研究的目标产物液大多是局限在简单分子,对于基因工程蛋白质及其有重要应用价值的其