基于高压液相色谱的大道牵引牵引诱导的大道牵引牵引过敏反应鉴定

基于高压液相色谱的大道牵引牵引诱导的大道牵引牵引过敏反应鉴定

过敏疾病被世界卫生组织列为21世纪的三大常因素之一。这是目前世界上的一个主要卫生问题。世界上过敏疾病的发病率为10%-30%。这种疾病包括过敏哮喘、过敏炎症和食物过敏。它们是临床上常见的疾病和多发性疾病。引起过敏疾病的主要有两类。首先，灰尘、花粉、蚊子和动物的羽毛。其次，蛋、奶、鱼、虾、贝类和其他食物中的过敏植物主要是鱼类、虾、贝类和其他过敏植物，占36%。注册输入是重要的海产食品。临床上，一些人经常食用输入输入，导致过敏反应（如皮疹等），这严重影响了人们的生活质量。目前，国内外还没有关于窒息过敏的文献。本文的目的是分离、识别和提取窒息过敏，为临床诊断和科学研究中的过敏疾病提供理论基础。1材料和方法1.1血清和试剂本实验所用缢蛏(Sinonovaculaconstricta)购于深圳市水产品市场,在冰上除去外壳后整体匀浆提取蛋白.过敏病人的阳性血清来自深圳市人民医院和深圳市儿童医院.生物素标记羊抗人IgE抗体购于KPL公司,链霉亲和素-HRP购于Vector公司,其他常用试剂购自上海生物工程有限公司.1.2方法1.2.1蛋白质提取和sds-表面电泳将样品在冰浴中匀浆破碎后,用丙酮浸泡放入4℃冰箱中去脂2d,其间冰浴中换丙酮5次,待脱脂的丙酮澄清后倒掉丙酮并在通风橱中风干.按每克样品20mL加入PBS进行蛋白提取,每天搅2~4h,一共提取2d.提完后用冷冻离心机在10000r/min,4℃条件下离心20min,取上清液用PBS液透析(透析带截流范围为6~8kD)2d,期间换液5次.透析完后,用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度,并取16μg进行SDS电泳,剩余的样品经冷冻干燥后放入-80℃冰箱保存.1.2.2nc膜的提取取含200μg蛋白的缢蛏粗提液进行SDS电泳,电泳完取出SDS凝胶,按凝胶的大小剪取NC膜,将胶和膜放入电转缓冲液中平衡20min后,在35V恒压下,于4℃冰箱中电转12h.用2%BSA封闭2h后将膜切成11条小带分别放入血清池中,1~9池中加入9位过敏病人的阳性血清,10池中加入阴性对照血清,11池加入前面9个病人的混合血清.摇床上摇2h后将NC膜转入生物素标记羊抗人IgE抗体(按1∶1000稀释)中摇2h.链霉亲和素HRP按1∶500稀释后将NC膜放入其中摇2h.最后DAB显色,待条带清晰后即用水冲洗终止显色反应.1.2.3roin-paktm135a诱导系统鉴定将提取的蛋白经HPLC的体积排阻柱纯化,柱子为Waters公司的protein-paktm125A预装柱.收集各峰后做SDS凝胶电泳,对比步骤1.2.1、1.2.2的结果,找出主要过敏原所在峰,对该峰用C4反相柱进一步纯化,纯化后的结果做免疫印迹进行鉴定.2结果2.1总分子量和含量分布缢蛏粗提液蛋白按每孔16μg上样的SDS结果如图1.蛋白条带有18条,含量高的有6条,分子量分别为110kD、55kD、42kD、38kD、35kD和28kD,其中以35kD处最为富集.35kD以上蛋白多且分布均匀,28kD以下蛋白含量相对较少.2.2血清学检测结果选用临床上对缢蛏过敏患者阳性血清(1-9号,11号为混合血清)以及正常阴性对照血清(10号)为一抗进行免疫印迹(western-blotting),结果见图2.除了阴性对照外,1-9号均出现了阳性条带,其中8号血清出现了4条阳性带,1号显示3条阳性带,2号、4号和5号各显示2条阳性带,3号、6号、7号和9号只显示1条阳性带,11号混合血清则出现5条阳性带.从表1可知,58kD条带的阳性率为100%,38kD条带的阳性率为44%,28kD条带的阳性率为33%,12kD条带的阳性率仅11%.世界卫生组织规定,阳性率大于50%为主要过敏原,所以58kD的蛋白是缢蛏的主要过敏原,38kD、28kD和12kD蛋白为缢蛏的次要过敏原.2.3sds-采用最优内容型蛋白液的构建为得到分子量58kD的主要过敏原,对缢蛏蛋白进行纯化.用Waters公司的protein-paktm125A预装柱进行体积排阻纯化,结果见图3.一共得到9个峰,前4个峰蛋白含量要远高于后5个峰,第1峰蛋白含量最高.收集各峰后做SDS检测,如图4.由图可见,经SDS鉴定,前4个峰蛋白含量较高,有清晰的条带,5-9峰蛋白含量较低,看不出条带.第1峰蛋白含量最高,条带也最多,纯度不高,2-4峰也都不止一条带.第4峰中有两条带,其中一条与已鉴定的主要过敏原分子量大小相符,取第4峰蛋白液进一步用HPLC反相纯化.2.4sds-东南角及western-blct基因信息鉴定图3中第4峰蛋白经HPLC反相纯化(如图5)后得两个峰,分别收集峰液做SDS和Western-blotting鉴定(如图6),发现第2峰在分子量58kD处出现阳性条带,与预期结果相符.因此,第2峰蛋白即缢蛏58kD主要过敏原蛋白.其它鱼类的典型引领物随着人们生活水平的提高,食物过敏越来越受到重视.根据流行病学调查,在美国约有2%~2.5%的人(600万~700万)产生过食物过敏,婴幼儿发病率约为4%~6%,儿童约为1%~2%,成年人食物过敏比例比婴幼儿低,但仍为1%~2%.重庆医科大学儿童医院在一年内对3040名2岁以下儿童进行食物过敏流行病调查,确诊160名儿童产生食物过敏,发病率为5.2%,高于美国发病率.食物过敏是世界各地普遍存在的不容忽视的问题.海鲜是人们日常生活中最主要蛋白质来源的食物,也是引起过敏性反应的常见食物.海鲜主要包括鱼类(fish)和贝甲类(shellfish).鱼类主要的过敏原为一种12kD左右的热稳定、水溶性、钙结合蛋白-小清蛋白(parvalbumin),如鳕鱼(cod)的AllergenMGadc1、鲑鱼(salmon)的Sals1、鲭鱼(mackerel)的Scoj1、Scos1及Scoa1,这种小清蛋白在鱼类中存在着交叉反应.因此,对某种鱼过敏的病人也可能同时对其它鱼过敏.本实验在8号病人血清的印迹条带中发现了一条12kD左右的过敏原,分子量大小与鱼类的小清蛋白接近,但它不是缢蛏的主要过敏原.至于它是否为小清蛋白,与鱼类是否存在交叉反应等,都有待实验进一步证实.贝甲类(shellfish)包括虾、蟹和软体动物(mollusk),它们的主要过敏原是一种热稳定的钙结合蛋白-原肌球蛋白(tropomyosin),其分子量约40kD左右.本实验的Western-blotting结果发现,近一半的缢蛏过敏患者有分子量为38kD左右的过敏条带,故推测它可能是一种原肌球蛋白.到目前为止,国内外还没有见到对缢蛏过敏原的报道,对缢蛏的研究主要集中在组织化学和个别功能基因的研究.本实验通过Wester