丙戊酸钠孤独症模型大鼠海马ca1的表达

丙戊酸钠孤独症模型大鼠海马ca1的表达

康复训练是一种以社会交际障碍、语言障碍和异常行为为主要特征的发展障碍疾病。这是自闭症（asd）中最常见的类型。EDuchan等收集近40年来的流行病学资料报道孤独症谱系障碍的患病率为2.75‰。2011年我国10省市的调查数据显示儿童孤独症总患病率为2.55‰;且患病率呈逐年上升趋势。除三大症状外,许多孤独症患者伴有中重度智力低下和行为问题,且治疗困难,给患者、家庭及社会造成严重的负担。本文通过建立丙戊酸钠(valproicacid,VPA)孤独症动物模型,观察VPA孤独症模型鼠海马CA1区核转录因子κB(Nuclearfactor-kappaB,NF-κB)和小清蛋白(Parvalbumin,PV)表达水平变化,探讨孤独症的发病机制,以期为完善孤独症的治疗方案提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物饲养管理全部Wistar大鼠均由北京维通利华实验动物有限公司提供。成年雌性Wistar大鼠[(220±35)g]15只与雄性Wistar大鼠[(320±25)g]30只。分别饲养在干净的笼舍内,给予充分的饲料和饮水。饲养温度在(20±2)℃,湿度保持在40%~60%,自然光照。所有实验动物喂养程序均严格按照青岛大学制定的实验动物保护条例执行。1.2方法1.2.1模型总饲养条件参照TSchneider等的方法建立孤独症动物模型。先将成年雌性(15只)与雄性Wistar大鼠(30只)分别饲养在干净的笼舍内,给予充分的饲料和饮水。饲养温度在(20±2)℃,湿度保持在40%~60%,自然光照条件下饲养数日使之适应环境。然后将1只雌性大鼠与2只雄性大鼠合笼过夜,于第2天早晨精确检查到阴栓的雌鼠记为胚胎第1天(E1)。将孕鼠与雄鼠分笼饲养。在E12.5天时按照600mg/kg的VPA(VPA粉用生理盐水配成250mg/mL溶液)给予模型组孕鼠腹腔注射;对照组孕鼠按等量的生理盐水腹腔注射。每只孕鼠单独笼子饲养,于E22天时模型组母鼠共产下子鼠97只,其中雌性41只,雄性56只;对照组母鼠共产下子鼠41只,其中雌性18只,雄性23只。出生当日记为生后第1天(P1),子鼠于P21d时断乳,区分雌雄子鼠后与母鼠分笼饲养。由于TSchneider等的研究发现孤独症模型组中雄鼠行为表现较雌鼠行为表现更接近孤独症患者的临床表现,故本次试验只研究雄鼠,剔除雌鼠。1.2.3免疫组化染色动物标本取材:每组随机选取12只雄鼠作为研究对象,在大鼠6周龄时,腹腔注射麻醉大鼠,以磷酸盐缓冲液配制的4%多聚甲醛300mL,心脏灌注约1.5h,取出脑组织于甲醛外固定过夜。常规脱水、石蜡包埋、丘脑水平连续冠状切片,用于海马CA1区免疫组化染色。其余步骤按试剂盒说明书操作。采用多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国MediaCybernetics公司ImageProPlus)对海马CA1区的免疫反应阳性细胞进行计数。进行400×的显微照相,每张切片测定部位随机选取5个视野,取平均值作为其平均阳性细胞数。海马CA1区锥体细胞观察:取切片行常规HE染色,光镜下(400×)观察海马CA1区锥体细胞形态学改变。1.3统计方法2结果2.1平均瞳眼时间和体重情况通过评价模型鼠与对照鼠的体重指标及睁眼时间,发现孤独症模型组雄鼠体重较对照组雄鼠低[(48.75±2.42)gvs(50.52±2.58)g,t=2.8973,P=0.0049];孤独症模型组雄鼠平均睁眼时间(14.94±0.84)d明显晚于正常对照组雄鼠(12.74±0.73)d,差异有统计学意义(t=10.9655,P=0.0000)。根据雄鼠的睁眼时间并结合体重情况与行为学表现,将孤独症模型鼠中睁眼时间和体重接近正常对照组的视为造模失败的雄鼠从模型组中剔除8只,这样孤独症模型组雄鼠48只;正常对照组雄鼠23只。孤独症模型组和正常对照组雄鼠中随机选取12只作为研究对象,其学习记忆能力表现为与正常对照组比较,孤独症模型组鼠的尝试次数增加,再现次数减少。见表1。2.2马下区1个区域的nf-b和pv阳性输出孤独症模型组和正常对照组雄鼠(与结果一中的雄鼠相同)海马CA1区NF-κB、PV免疫阳性细胞数差异有统计学意义。见表2。3讨论3.1拉普氏模型的小鼠育种和评价3.2免疫组织中nf-b的表达近年来的研究显示中枢神经系统的炎症和细胞凋亡与孤独症有关。NF-κB广泛存在于多种细胞,参与与多种病理生理活动,如免疫应激、炎症反应、细胞凋亡和细胞黏附等,是一种具有调节炎症和凋亡过程中细胞反应的重要转录因子,提示NF-κB可能和孤独症发生有关。本研究结果发现与正常对照组子鼠比较,孤独症模型组子鼠海马CA1区NF-κB的表达增强,提示CA1区NF-κB的变化可能在孤独症的发生中发挥作用。小清蛋白(parvalbumin,PV)是一种钙结合蛋白,是抑制性系统的主要神经化学物质。王维霞等证实孤独症模型鼠的前额叶皮质、杏仁体及海马中的PV阳性神经元形态和数量均发生不同程度的变化,提示PV及PV阳性神经元与孤独症的发病相关。本研究结果发现与正常对照组鼠比较,孤独症模型鼠海马CA1区PV的表达增强。ISplawski等研究发现ASD患者T型钙通道基因CACNA1H发生突变,而这种突变可能导致钙通道活性减低,造成细胞内Ca2+减少、神经元兴奋性减弱,这些改变对大脑的发育产生影响。PV也是一种钙结合蛋白,在调节神经元膜内外钙平衡过程起重要作用,PV表达水平的变化可能通过这一机制在孤独症的发病中发挥作用。总之,本研究通过建立VPA孤独症动物模型来探讨孤独症可能的发病机制,发现孤独症模型鼠海马CA1区NF-κB和PV阳性神经元的表达水平改变,而这种改变可能与孤独症的发生有关,当然还需要大量的基础及临床试验进行进一步验证。1.1.2par主动型抗bs-1339r丙戊酸钠(VPA,Sigma)。一抗:NF-κB-p65一抗BA2311(博士德),Parvalbumin一抗BS-1299r(博奥森);二抗:SP-9001(中杉)。DAB显色剂(中杉);磷酸盐缓冲液(PBS)(石家庄德萨商贸);多聚赖氨酸(sigma);苏木素染液(石家庄德萨商贸)等。1.2.2雄鼠学习能力检测参照TSchneider等报告的造模与评价方法,分别记录模型组和对照组雄鼠在生后12~16d睁眼情况、行为表现以及雄鼠P21d断乳时的体重;P28d时采用Y型电迷宫测试模型组和对照组雄鼠的学习记忆能力。Y型电迷宫学习记忆能力测试方法如下:在较暗、安静的环境下进行测验,将雄鼠放入迷宫的任何一臂中,雄鼠在三条臂内自由活动,熟悉环境5min后雄鼠所在的臂为起始臂,给予电刺激(电压50V,电流0.4~0.6mA,延迟5s),而其余两臂中的任一臂给予灯光信号(安全区)。雄鼠进入安全区即为正确反应,否则为错误反应。以连续9次正确反应后的次数为雄鼠学习行为能力,达到学会标准所需训练次数(尝试次数)越少表示雄鼠学习能力越强。记忆功能测试检验:间隔24h依照上述方法再次测试,连续测试10次并记录正确反应次数(再现次数),以再现次数作为雄鼠的记忆功能。应用SPSS17.0统计软件对相关数据进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。HSGo等的研究证实VPA可通过活化NF-κB信号通道和上调Bcl-XL的表达来抑制神经祖细胞的死亡,而这可能与智力缺陷和类孤独症行为有关。KMDalton等研究也发现大鼠胚胎发育的第11天到第13天是神经管闭合的阶段,在此阶段接触VPA可能影响神经系统正常发育分化,使后代在发育特征和行为表现方面与人类孤独症患者临床表现相近。多年的研究发现VPA动物模型具有良好的表现效度、结构效度,重复性好,是一种较为经典的建模方式。TSchneider等在大鼠妊娠的第12.5天时通过腹腔注射VPA建立孤独症动物模型,观察大鼠行为特征的改变,发现与孤独症患儿的行为极为相近。本研究参照TSchneider等的方法建立孤独症动物模型,模型鼠表现出明显的行为学异常,体现在孤独症模型鼠的睁眼时间较正常对照鼠晚;孤独症模型鼠P21