硫化氢对低氧性肺血管重塑大鼠、型胶原mrna表达的影响

硫化氢对低氧性肺血管重塑大鼠、型胶原mrna表达的影响

肺血管重建是重要的低氧化性动脉高压（hph）的病理基础。核电站重建是低氧化性肺血管重建的主要内容之一。对其调节机制的研究是该领域的中心主题。以往人们认为硫化氢(H2S)为毒性废气,最近我们发现,H2S在心血管系统可内源性生成,并具有重要的生理及病理学效应,提出H2S是心肺血管功能调节的新型气体信号分子,对低氧诱导的肺动脉高压和肺血管重塑有明显的缓解作用。本组研究以HPH大鼠为研究对象,观察H2S对大鼠肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响,进一步探讨H2S缓解低氧性肺血管重塑的作用机制。材料和方法一、低氧和低氧+nahs对大鼠的mic本组实验得到北京大学第一医院实验及伦理委员会的许可。健康雄性Wistar大鼠(首都医科大学实验动物中心提供)19只,体重180~200g,随机数字表法将大鼠分为:对照组(6只),低氧组(7只),低氧+硫氢化钠(NaHS)组(6只)。参照薛全福等方法进行:低氧舱有缝隙与外界大气相通,可供舱内气体缓慢进出,使舱内气压与大气压始终保持平衡;进行低氧处理时,将大鼠放入低氧舱内,向舱内通入氮气,替换舱内的部分氧气,从而使舱内氧浓度下降;舱内混合气体用小风扇不断混匀,用氧浓度监测仪(RSS-5100型,上海雷磁公司)随时监测舱内的氧浓度;通过调节减压阀和气体流量表控制注入舱内的氮气流量,使舱内氧浓度保持在(10.0±0.5)%。将低氧组和低氧+NaHS组大鼠置于常压低氧舱内(10%O2、90%N2),每次连续低氧6h(10∶00~16∶00),每天低氧处理1次,共持续21d。对低氧+NaHS组大鼠每天低氧前腹腔注射H2S供体NaHS溶液(14μmol/kg,每次使用前新鲜配制);低氧组及对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。3组大鼠饮食及饮水条件相同。二、动脉和颈动脉插管测量低氧结束后,给大鼠腹腔注射乌拉坦1.2g/kg体重麻醉,肺动脉插管测定肺动脉平均压(mPAP),颈动脉插管测定体循环平均压(mAP)。打开胸腔取出心脏,分别称量右心室(RV)和左心室+室间隔(LV+SP)重量。计算RV/(LV+SP)。三、对苯二胺盐酸盐分光光度法检测对苯二胺盐酸盐上清液的吸收剂ab的活性采用亚甲蓝分光光度法。在试管中加入0.5ml1%醋酸锌,然后加入0.1ml血浆标本混匀,再加入0.5ml20mmol/L对苯二胺盐酸盐和0.5ml30mmol/L三氯化铁,室温孵育20min。再加入1ml10%三氯醋酸沉淀蛋白,加2.5ml蒸馏水补足体积至5ml。离心5min,吸出上清液,在670nm处检测上清液的吸光度(A)值。根据标准曲线计算上清液中H2S含量。四、肺组织中和型胶原的检测1.i型和ii型胶原免疫组化Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化试剂盒均购自天津TBD公司。参照说明书进行。2.i型和ii型前胶原mrna的原位置混合Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司,参照说明书进行。3.肺血管壁型和型胶原表达强度的变化光学显微镜下,棕黄色颗粒为阳性信号。参照齐建光等方法,采用半定量积分的方法对肺血管壁的Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达强度进行分析。每张切片中的肺小型肌性动脉(外径<50μm)和肺中型肌性动脉(外径约50~150μm)随机各检测10条。五、统计学处理方法数据以x¯±sx¯±s表示,使用SPSS10.0统计分析软件,采用单因素方差分析(ANOVA)对多组数据进行均数比较,进一步做组间比较采用Bonferroni检验。结果一、低氧和nahs对大鼠mpap的影响3组大鼠mPAP、RV/(LV+SP)比较差异均有统计学意义(P均<0.01,表1)。与对照组相比,低氧组大鼠mPAP升高46%(P<0.01);并伴有右心室肥厚,RV/(LV+SP)增加41%(P<0.01)。与低氧组相比,低氧+NaHS组大鼠的mPAP降低31%;RV/(LV+SP)减少24%(P<0.01)。二、s-l-mf含量血浆H2S含量在3组大鼠之间差异有统计学意义(F=38.93,P<0.01)。与对照组H2S含量[(302±32)μmol/L]比较,低氧组[(192±22)μmol/L]显著下降36%(P<0.01);与低氧组比较,低氧+NaHS组[(317±36)μmol/L]显著升高65%(P<0.01)。三、动脉中型胶原及其前胶原的mrna显示1.小型肌性动脉型胶原蛋白表达增加肺小型和中型肌性动脉管壁Ⅰ型胶原蛋白表达在3组间比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。低氧组肺小型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白的表达较对照组增加81%(P<0.01);而低氧+NaHS组较低氧组减少了32%(P<0.01)。低氧组肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组增加62%(P<0.01);而低氧+NaHS组较低氧组减少18%(P<0.01)。2.低氧+nahs对小鼠肺小型肌性动脉型前胶原mrna表达的影响Ⅰ型前胶原mRNA在肺小型和中型肌性动脉中的表达在3组间比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。低氧组肺小型肌性动脉Ⅰ型前胶原mRNA表达较对照组增加49%(P<0.01);而低氧+NaHS组较低氧组减少31%(P<0.01)。低氧组肺中型肌性动脉中Ⅰ型前胶原mRNA表达较对照组增加68%(P<0.01);而低氧+NaHS组较低氧组减少33%(P<0.01)。四、动脉内塌陷型及其前胶原mrna显示1.不同氧处理对肺小型肌性动脉型胶原蛋白表达的影响肺小型、中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达在3组间比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。低氧组肺小型肌性动脉中Ⅲ型胶原蛋白表达较对照组增加84%(P<0.01);而低氧+NaHS组较低氧组减少了37%(P<0.01)。低氧组肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达较对照组增加38%(P<0.01);但是低氧+NaHS组与低氧组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.两组小鼠血清中前胶原mrna表达比较Ⅲ型前胶原mRNA在肺小型和中型肌性动脉中的表达在3组间比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。低氧组肺小型和中型肌性动脉Ⅲ型前胶原mRNA表达较对照组分别增加53%和17%(P<0.01);而低氧+NaHS组较低氧组分别减少了45%和33%(P<0.01)。低氧性肺血管重塑的hs和nahs低氧性肺血管重塑既包括中膜平滑肌细胞的异常增殖,也包括细胞外基质的改变。细胞外基质主要包括胶原蛋白和弹性蛋白。在血管壁中存在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型等不同类型的胶原,其中Ⅰ型胶原与血管壁的韧性和抗张力有关,Ⅲ型胶原与血管壁的弹性有关。Ⅰ、Ⅲ型胶原是血管壁中不可缺少的主要胶原成分,在维持血管的完整性方面具有重要作用。研究显示,随着HPH的形成,大鼠肺动脉羟脯氨酸(代表胶原)含量特异性升高,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达及其前胶原mRNA也有明显增加。因此,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在血管壁的异常沉积是低氧性肺血管重塑的重要病理过程。本组研究证明,经3周低氧处理,大鼠血浆H2S水平下降,并形成HPH,表现为mPAP明显增加,RV/(LV+SP)升高。同时Ⅰ、Ⅲ型胶原及其前胶原mRNA在肺小动脉中的表达均有明显增加。迄今为止,低氧性肺血管结构重塑的形成机制还不清楚。气体信号分子如一氧化氮与一氧化碳具有快速产生、迅速弥散、作用广泛等生物学特性,它们的发现将肺动脉高压发病机制研究带入了新的阶段。以往的研究提示,一氧化氮和一氧化碳在低氧性肺血管结构重塑中发挥重要的调节作用。然而低氧性肺血管重塑的形成机制非常复杂,至今还不明了。在诸多内源性生成的气体分子中,探寻对心肺血管调节具有重要作用的新型气体信号分子并揭示其对肺血管重塑的可能作用机制是该领域的重大前沿课题。本课题组最近研究发现,H2S可在心血管系统内源性生成,提出了H2S为心血管系统功能调节的新型气体信号分子。H2S的发现和研究也受到国际上高度关注。更为重要的是,我们近来发现,在大鼠HPH时,体内H2S体系下调;外源性给予H2S供体NaHS后,对低氧诱导的肺动脉高压和肺血管重塑有明显的缓解作用。提示H2S在低氧性肺血管结构重塑中发挥重要作用。然而它对低氧性肺血管重塑的调节机制还不清楚。本组研究发现,低氧+NaHS组大鼠血浆H2S水平较低氧组大鼠升高,肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型胶原及其前胶原mRNA的表达较其在低氧组大鼠肺血管中明显减少,提示H2S对Ⅰ、Ⅲ型胶原在肺血管壁的异常沉积有抑制作用,这可能是H2S缓解低氧性肺血管重塑机制之一。关于H2S抑制胶原异常堆积的分子机制还不清楚,是否与其抑制了肺动脉平滑肌细胞表