普洱茶特征成分提取物抗疲劳、降胆固醇及毒理学效应研究

普洱茶特征成分提取物抗疲劳、降胆固醇及毒理学效应研究

普洱茶是云南汉江流域茶树的起源地。这是在云南茶叶的新鲜过程中经过加工而成的一种特殊茶。它是由云南的干绿茶通过缓慢自然、自然、人工和固体发芽而制成的发酵茶，包括普洱散茶和普洱散茶。还有独特的质量特点。茶色苍白，汤色红淡，香味独特，陈香，叶底褐红色，口感温和甘甜。现代医学临床验证,普洱茶对人体有保健作用。如:降脂减肥、抗动脉硬化、防癌与抗癌、护胃、养胃及抗衰老等作用。在普洱茶加工过程中,大部分的多酚类物质、茶黄素及茶红素氧化、聚合,形成茶褐素(TB),使其含量成倍增加,从而使茶汤的收敛性和苦涩味明显降低。此外,水溶性多糖大幅度增加,为形成云南普洱茶特有的功能与品质奠定了基础[3~6]。为了进一步证明这些成分所起的作用以及为普洱茶深加工提供重要参考,本文探讨了普洱茶特征成分提取物对昆明种小白鼠的抗疲劳、降胆固醇及其毒理学效应。1材料和方法1.1实验动物清洁级(动物合格证号SCXK(渝)20020004)昆明种小白鼠,由第三军医大学实验动物中心提供。1.2加沉淀物中加味茶质成分提取物的制备先将普洱茶用热水浸泡,过滤后的滤液再用乙醇沉淀,此沉淀物经真空干燥后即得普洱茶特征成分提取物,其主要由茶褐素58.3%,可溶性多糖33.3%,可溶性蛋白质8.0%及少量的茶红素、茶黄素、水溶性果胶等组成。1.3功能实验方法：从普洱茶中提取资源成分1.3.1小鼠尾血及血清尿素氮的测定采血及饲喂方法:实验小鼠先按常规方法饲喂一周,使其适应环境,减少应激反应带来的不便和实验误差。普洱茶特征成分提取物组:每天饲喂普洱茶特征成分提取物每只鼠25mg(相当于每公斤体重饲喂500~600mg),连续饲喂10d。普洱茶水浸液组:每天饲喂普洱茶水(将250mg普洱茶浸泡于热水中,过滤得浸泡液10ml),连续饲喂10d。对照组:每天供给足量的蒸馏水和饲料,连续饲喂10d。各组小鼠试验过程中,正常供给饲料。采取饲喂前后小鼠尾血,分离血清后置于Eppendorf管中,4℃冰箱保存,用于游泳前血清尿素氮的测定。游泳试验:小鼠取尾血后,在28±2℃水浴中游泳1h,泳后1~1.5h,再次取尾血分离血清,4℃冰箱保存,用于游泳后血清尿素氮测定。存活小鼠继续喂养。运动耐力测定:将小鼠置于28℃±2℃水浴中游泳,直至全部淹死为止,记录每只小鼠游泳持续时间(致死时间)。血清尿素氮增量测定:血清中尿素在氨基硫脲存在下,与二乙酰一肟在酸性溶液中混合加热,经Fe3+的催化缩生成3-羟-5,6-二甲基和1,2,4-三嗪红色化合物,其颜色深浅与尿素含量呈正比。将样品与试剂混匀后,置于沸水浴中10min,取出用流水冷却,以520nm波长或绿色滤光片比色,用空白管调零,读取测定管及标准管的吸光光度值,按下列公式计算:血清尿素氮(mmol/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×0.375×1000×0.2×0.1泳后泳前差值即为血清尿素氮增量。1.3.2饲料配方的制备采血及饲喂方法:实验小鼠先按常规方法饲喂一周,使适应环境,减少应激反应带来的不便和实验误差。一周后对小鼠采取尾血分离血清,4℃冰箱保存,用于测定饲喂样品前血清中总胆固醇的含量。次日开始饲喂样品(饲喂剂量同1.3.1),连续饲喂10d。试验第11d,再次采尾血分离血清,4℃冰箱保存,用于测定饲喂样品后的血清中的总胆固醇的含量。胆固醇测定方法:血清经无水乙醇处理,蛋白质被沉淀,胆固醇及其酯则溶在无水乙醇中,在乙醇提取液中加磷硫铁试剂(即浓硫酸和三价铁溶液),胆固醇及其酯与试剂形成较稳定的紫红色化合物,呈色程度与胆固醇及其酯含量成正比,可用比色法(560nm)定量测定。1.4本品系提取的解毒实验方法1.4.1饲料及实验设计实验动物:昆明种小白鼠;性别和数量:20只,雌雄各半;动物年龄:7周龄;动物体重:18~22g;实验环境和条件:室温23±2℃,湿度60±20%,自动通风,光照14h。饲料由第三军医大学实验动物中心提供,自由摄食和饮用自来水,饮水每日换一次;禁食时间:给药前禁食12~16h。实验设计:依照我国卫生部颁发的《新药审批办法》和《新药临床前研究指导原则汇编》中有关规定。单次给药预试验结果如表1。剂量及分组:参考预实验结果,设立10.0g/kg体重1个剂量组,共20只小白鼠,雌雄各半。供试品给予途径及给药容量:灌胃,给药容量为0.5ml/10g体重。单次给药,药后立即观察、记录动物的中毒反应、死亡情况及时间,连续观察14d。1.4.2茶树叶片细菌活性检测试剂:阳性对照组:直接诱变剂丝裂霉素C(mitomycinC,MMC)(0.5µg/皿)、四硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline1-oxide,4-NQO)(0.5µg/皿)和正定霉素(40µg/皿);间接诱变剂2-氨基芴(60µg/皿);均系Sigma化学试剂公司产品,4℃保存。菌株:选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102,由美国加州大学Ames.BN教授惠赠。菌株保存方式:液氮冷冻保存。菌株增菌培养:将细菌接种在肉汤培养基中,在37℃,空气振荡(100~120r/min)条件下连续培养约10h。菌株遗传特性:TA97、TA98、TA100和TA102四株测试菌株除具有组氨酸合成缺失突变外,还具有细胞壁脂多糖缺失突变和含有抗性R因子,前者可增加受试物渗透进入细胞的能力,而后者使细菌产生氨基苄青霉素抗性并增加检测的敏感性。另外,TA97、TA98和TA100三菌株还具有切除修复系统缺失突变(紫外线敏感),而TA102则具有四环素抗性因子。大鼠S9活化系统的制备:大鼠诱导采用苯巴比妥酸和β-奈黄酮联合诱导方法,雄性大鼠体重180~220g,腹腔注射诱导剂,5d后杀鼠制备肝匀浆。肝匀浆的制备:将大鼠断头处死,75%乙醇皮毛消毒,开腹取出肝脏称重,将肝组织剪碎后,用0.15mol/LKCl溶液洗涤4~5次。以每克肝重加3ml0.15mol/LKCl溶液的比例将肝组织放入匀浆器中制成匀浆,9000g离心10分钟,取其上清夜(S9)分装塑料管(2ml/管)。液氮或-75℃冰箱冷冻保存。每毫升S9混合液组成如下:0.1mlS9;8µmolMgCl2;33µmolKCl;5µmolG-6-P;4µmolNADP;0.5ml磷酸缓冲溶液(pH7.4)。S9混合液在临用前配制。诱变性试验方法:诱变性实验采用平皿掺入试验保温法。将0.1ml供试品溶液或溶媒、0.1ml增菌液和0.5ml磷酸缓冲溶液(pH7.4,0.2mol/L)或0.5mlS9混合液加入无菌试管(13×100mm)内,37℃振荡培养20min,振荡频率约120r/min,然后向试管中加入2ml融化的顶层琼脂(顶层琼脂加入前维持45℃水浴中)。振荡混悬管中成分后,铺至基础培养基平皿表面。待顶层琼脂凝固后,将平皿倒置放入培养箱中,37℃培养约48h。每测试浓度在活化和非活化条件下各作三个平皿,重复试验一次。最终结果取两次试验结果的平均值。分组:普洱茶特征成分提取物设5000、1000、100、10µg/皿和1µg/皿五个测试浓度。设空白对照,S9对照及阳性诱变剂对照。直接诱变剂为0.5µg/皿MMC、0.5µg/皿4-NQQ(TA97、TA100),40µg/皿正定霉素(TA98),间接诱变剂2-氨基芴(60µg/皿)。菌落计数:显微镜下确定细菌背景菌苔生长良好,与溶剂对照相比无明显稀疏的条件下进行回变菌落计数,用自动菌落计数仪计数。结果观察与判断:采用沙门氏菌诱变性实验预培养试验方法,在加S9活化和非活化两种条件下进行试验。每测试点做三个平行样本,并重复试验一次。实验设空白对照、S9对照及相应的阳性对照。再确认细菌背景生长良好的条件下,计数回变菌落数。如供试品引起的回变菌落数超过对照组一倍以上,并有剂量反应关系时,判断供试品诱变实验阳性,否则是阴性。统计分析:对数据进行方差分析。1.4.3普洱茶特征成分提取物、大鼠骨髓细胞微测试1.4.4体外诱变剂、药物作用时间及染色体畸变试验细胞:中国仓鼠肺细胞CHL(ChineseHamsterLungFibroblast,CHL),经鉴定细胞核型稳定,无支原体污染。细胞来源:卫生部药检所;保存方式:细胞贮存液态氮中。细胞培养条件:细胞培养用RPMI-1640培养基,放入37℃、5%CO2培养箱中培养。制备,贮存在-86℃超低温冰箱中。采用苯巴比妥钠和β-奈黄酮联合诱导方法剂量:通过细胞毒性试验以及直线回归法计算细胞存活率50%细胞生长抑制浓度,IC50=5000µg/ml。据表2的结果,本试验选择5000、2500、1250µg/ml和500µg/ml四个剂量组。生理盐水对照及S9混合液0.5ml分别为阴性对照;直接诱变剂丝裂霉素C(MMC)0.25µg/ml及间接诱变剂环磷酰胺(CP)20µg/ml,分别为阳性对照。代谢活化:为弥补传代培养细胞没有代谢活化系统,用苯巴比妥钠和β-奈黄酮联合诱导大鼠肝微粒体酶进行体外代谢活化试验。药物作用时间:在无代谢活化条件下,药物与细胞作用24h及48h收获细胞。有代谢活化条件下,药物、S9混合液与细胞作用6h,洗涤、换液,于给药后24h及48h收获细胞。标本制作时间:药物与细胞作用24h及48h收获细胞,制作标本。镜检:每一浓度在油镜下分析100个中期分裂相。分别记录染色体数目及结构畸变。结果判定:参照《新药(西药)临床前研究指导原则》。2结果与分析2.1本普洱茶提取物的生理作用2.1.1茶树活性成分提取物对小鼠血清尿素氮、运动公信力的影响抗疲劳作用主要与人或动物体内蛋白质和含氮化合物的分解、形成血清尿素氮的形成速度有关。抗疲劳物质能有效地减少体内蛋白质和含氮化合物的分解,降低血清尿素氮的形成,提高肝糖原和肌糖原的贮备能力,从而提高机体的耐力和速度。用小鼠作动物模型,抗疲劳物质还能明显延长实验小鼠在水中游泳存活时间。本试验通过测定实验小鼠血清尿素氮增量及实验小鼠在水中游泳存活时间、来确定普洱茶特征成分提取物和普洱茶水浸液的抗疲劳作用能力。图1表示游泳前后小鼠血清尿素氮含量的变化。从图1可以看出,普洱茶特征成分提取物组小鼠泳前泳后的血清尿素氮增量最小,普洱茶水提取物居中,对照组小鼠泳前泳后的血清尿素氮增量最大。小鼠运动耐力(致死时间)测定结果也表明,普洱茶特征成分提取物组小鼠游泳时间持续391.5±68.2min(n=4),显著高于普洱茶水提取物组小鼠(252±67.3min,n=4)和对照组小鼠(250.5±68.7min,n=4)。抗疲劳试验结果表明,由茶褐素、茶多糖和蛋白质组成的复合体的抗疲劳效果较普洱茶水提取物的效果显著,而普洱茶水提取物的抗疲劳效果在本试验中并不显著。试验结果还表明,普洱茶抗疲劳作用并非完全由咖啡碱所引起,而茶褐素、茶多糖以及茶蛋白等组成的复合体同样具有抗疲劳作用。但具体是何成分起作用,正在研究之中。2.1.2加味加热对血清胆固醇含量的影响许多流行病学研究均证明血清胆固醇水平与冠心病发病率有联系,降脂药物均有副作用,不利于长期使用,且中止服药后血脂迅速上升,因此必须注意饮食治疗。本实验用比色法测定血清胆固醇含量,计算实验动物饲喂样品前后的血清胆固醇含量差值,而判断普洱茶特征成分提取物和普洱茶水浸液的降胆固醇作用。试验结果见图2。从图2可知,饮用普洱茶特征成分提取物比饮用普洱茶水提取液的降胆固醇效果更好,与对照(蒸馏水)相比,达显著水平。由于茶褐素、茶多糖在普洱茶发酵过程中均大幅度增加,这为普洱茶奠定了良好的品质基础。2.2本产品提取物的毒性评价由于普洱茶特征成分提取物具有较好的保健作用,为了更好地开发利用普洱茶特征成分,我们评价了普洱茶特征成分提取物的毒理学。2.2.1小鼠单次灌胃加热实验普洱茶特征成分提取物的小鼠经口急性毒性试验表明,小鼠无明显抑制性症状,如活动减少、伏卧不动等。个别小鼠有严重中毒症状。按照《新药临床前研究指导原则汇编》之规定,本实验连续观察14d。小鼠单次灌胃普洱茶特征成分提取物(20.0g/kg)后,死亡均发生在第一天,20只小鼠中有1只死亡,第二天起小鼠活动自如,皮毛光滑,未再出现死亡,存活动物体重无明显变化。选用1993年7月卫生部药政司颁布的《新药临床前研究指导原则汇编》中推荐的Bliss法,在微机上运行《药理学计算与程序》之P33计算LD50及其95%可信限:LD50为>10g/kg体重。2.2.2细菌回复突变实验鼠伤寒沙门氏菌诱变性实验是目前广泛应用的致突变性试验方法,具有快速、灵敏的特点,其结果对于评价供试品的遗传毒性具有重要价值。普洱茶提取物在S9活化和非活化两种测试条件下,1~5000µg/皿测试浓度范围内,诱发TA97、TA98、TA100和TA102产生的回变菌落数与阴性对照组相比均无明显增加。上述结果表明在1~5000µg/皿测试浓度范围内,普洱茶提取物对TA97、TA98、TA100和TA102四种测试菌株均无致基因突变作用(见表3)。直接诱变剂MMC(0.5µg/皿)、4-NQQ(0.5µg/皿)和正定霉素(40µg/皿)和间接诱变剂2-氨基芴(60µg/皿),在相应试验条件下,诱发四菌株产生的回变菌落数均超过阴性对照组两倍以上,表明所用实验系统可靠。2.2.3加样对骨髓嗜多染红细胞的微核试验检测小鼠普洱茶特征成分提取物5.0g/kg灌胃给药后12、24、36、48h和72h,对骨髓嗜多染红细胞的微核率无明显影响(见表4)。根据上述结果,选定取材时间为给药后24h。普洱茶特征成分提取物5.0、1.0、0.5g/kg和0.1g/kg四个剂量组给药后24h,对骨髓嗜多染红细胞的微核率无明显影响(见表5)。各组微核率分别为2.67±1.11‰、2.00±1.15‰、3.00±1.00‰和2.17±1.34‰,与溶剂对照组1.67±0.75‰相比较,P>0.05,无显著性差别。而环磷酰胺(CP)阳性对照组微核率高达30.0±2.0‰,与溶剂对照组相比较,经统计学检测差异非常显著(P<0.01),表明本系统可靠。说明在本实验条件下,普洱茶特征成分提取物对昆明种小鼠无致骨髓细胞微核形成作用。2.2.4茶树幼苗对chl细胞染色体畸变率的影响CHL染色体畸变试验目前广泛应用的致突变试验方法,具有快速、灵敏的特点,其结果对于评价样品的遗传毒性具有重要价值。在本试验中,无论是24h及48h收获细胞进行染色体畸变分析,空白对照、溶剂对照、S9混合液对照染色体畸变率在正常范围(见表6),在S9活化和非活化两种测试条件下,普洱茶特征成分提取物在500~5000µg/ml浓度范围内染色体畸变率也在正常范围,因此,在本试验系统条件下,普洱茶特征成分提取物在500~5000µg/ml浓度范围内未见诱发CHL细胞染色体畸变率增高。直接诱变剂丝裂霉素C(MMC,0.25µg/ml)染色体畸变率显著增高。间接诱变剂环磷酰胺(CP,20µg普洱茶特征成分提取物/ml)无S9混合液时染色体畸变率在正常范围,有S9混合液时染色体畸变率显著增高,表明本试验系统可靠。3加标对小鼠骨髓细胞微核试验小鼠实验系统:昆明种小白鼠;性别和数量:雄性,每组6只;年龄:40日龄;体重:19~22g;小白鼠每笼5只,室温25±5℃,湿度80±10%,自动通风,光照14h。自由饮用自来水,每日换一次。试验设计:试验设计依据为