20r-人参皂苷rg3对内皮细胞损伤的保护作用及其机制

20r-人参皂苷rg3对内皮细胞损伤的保护作用及其机制

动脉硬化是脑梗死、心脏病发作、坏疽和肢体功能丧失的主要原因之一。开始事件是由内皮细胞损伤引起的。内皮细胞被诱导分泌多种细胞因子,吸引炎性细胞的趋化和黏附,致使动脉粥样斑块形成。动脉粥样硬化是对血管损伤的过度炎症反应,其斑块中有大量的炎症介导物。肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的糖蛋白,是炎症反应的关键调节因子之一,可从多种不同的炎症细胞中释放,在动脉粥样硬化发生发展中起着关键的作用。血管内皮细胞表面存在着TNF-α受体,为TNF-α主要的靶细胞之一,与正常细胞相比,其在动脉粥样硬化病变中的表达明显增加。TNF-α作用于血管内皮细胞,一方面增加黏附分子的表达水平,促进对中性粒细胞的黏附作用;另一方面使血管内皮细胞产生其他炎性介质,如白细胞介素-6和白细胞介素-8等,共同介导病变血管的炎症反应。TNF-α损伤血管内皮细胞后,产生明显的病理和生理学变化,从而启动局部的炎症反应和粥样斑块的形成。因此,研究保护血管内皮细胞的药物将有利于动脉粥样硬化的早期防治。20(R)-人参皂苷Rg3是从传统中药三七叶中提取分离得到的四环三萜类二醇型皂苷单体化合物,而五加科植物三七主要分布于我国西南部,是云南省盛产的名贵中药材,它具有散淤止血,消肿定痛之功效。本研究通过观察20(R)-人参皂苷Rg3对TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)损伤的保护作用,探讨其对动脉粥样硬化的可能机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1细胞植物1.1.2培养基和指示剂20(R)-人参皂苷Rg3,纯度98.5%,由昆明医学院化学教研室詹尔益教授提供。尼莫地平注射液购自山东方明药业股份有限公司;注射用尿激酶购自丽珠集团丽珠制药厂;RPMI1640培养基干粉购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠(SDS)、TNF-a均购自Sigma公司;噻唑蓝(MTT)购自Bebco公司;荧光指示剂Fura-2/AM购自ANASPEC公司;组织型纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,t-PA)、1型纤溶酶原激活物抑制物(type-1plasminogenactivatorinhibitor,PAI-1)浓度测定试剂盒均购自上海太阳生物技术有限公司。1.1.3差显微试验二氧化碳培养箱(德国Hereaus);倒置相差显微镜(日本Olympus);酶标仪(Bio-radModel680,日本);双波长荧光分光光度计(RF-5000,日本岛津公司)。1.2细胞培养及分组按参考文献方法,将HUVEC按1×105个/mL的细胞密度接种于96孔板上,置37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育,培养24h后,换无血清RPMI-1640培养液继续孵育24h,将细胞分为正常对照组和TNF-α损伤组。正常对照组:加入无血清1640培养基;TNF-α损伤组:加入含TNF-α终质量浓度为40、20、10、5、2.5μg/L的无血清1640培养基,每一浓度设5个平行孔,作用时间为12、24、48h,实验重复4次。噻唑蓝法检测细胞存活率,以确定最佳实验条件。1.3复孔制备个人信息将HUVEC按1×105个/mL的细胞密度接种于96孔板上,分为空白对照组、模型组(TNF-α20μg/L)、20(R)-人参皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L浓度组,每个浓度均设5个复孔,实验重复4次。在含10%胎牛血清的1640完全培养基中培养24h,然后用含无血清的RPMI1640继续培养24h。预先加入上述终浓度的20(R)-人参皂苷Rg3培养细胞24h后,将TNF-α加入模型组和20(R)-人参皂苷Rg3各组,TNF-α刺激细胞24h,用噻唑蓝法检测细胞活性。1.4细胞内游离钙浓度的测定Fura-2/AM荧光探针负载细胞成功后,用Tyrode-HEPES缓冲液调整细胞数至1×106个/mL,将细胞悬液吸入有搅拌装置的石英杯中,用双波长荧光光度法测定细胞内游离钙浓度。细胞悬液分为正常对照组、模型组(TNF-α20μg/L)、20(R)-人参皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L浓度组、50μmol/L尼莫地平组,每个浓度均设5个复孔,实验重复4次。用直线回归方法计算药物影响钙浓度的半数抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50)。1.5细胞培养和tnf-活性将HUVEC按1×105个/mL的细胞密度接种于96孔板上,分为空白对照组、模型组(TNF-α20μg/L)、20(R)-人参皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L浓度组、20000IU/mL尿激酶组,每个浓度均设5个复孔,实验重复4次。在含10﹪胎牛血清的1640完全培养基中培养24h,然后用含无血清的RPMI1640继续培养24h。预先加入上述不同浓度的20(R)-人参皂苷Rg3培养内皮细胞24h后,将TNF-α加入模型组和20(R)-人参皂苷Rg3各组,TNF-α刺激细胞24h后,吸取每孔上清液-20℃保存,采用酶联免疫吸附法测定细胞上清液t-PA和PAI-1浓度。用直线回归方法计算药物影响PAI-1浓度的IC50。1.6方差分析和q检验采用SPSS11.5统计软件进行分析,所有数据用(x±s)表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同存活率率比较不同浓度TNF-α作用12、24、48h细胞存活率比较,详见表1。通过实验选定TNF-α损伤HUVEC的条件:TNF-α的浓度为20μg/L,损伤时间为24h,在此条件下细胞损伤适中。2.2对照组、模型组和不同浓度为20r的人参糖苷rg3组的huvec活性对照组、模型组及不同浓度20(R)-人参皂苷Rg3组HUVEC活性(吸光度A值)比较,详见表2。2.3不同处理对huvdc内钙离子浓度的比较对照组、模型组、不同浓度20(R)-人参皂苷Rg3组及尼莫地平组HUVEC内钙离子浓度比较,详见表3。直线回归方法计算20(R)-人参皂苷Rg3影响钙浓度的IC50为67.2μmol/L。2.4尿激酶对t-pa及pai-1浓度的影响对照组、模型组、不同浓度20(R)-人参皂苷Rg3组及尿激酶组t-PA及PAI-1浓度比较,详见表4。直线回归方法计算20(R)-人参皂苷Rg3抑制PAI-1浓度的IC50为36.9μmol/L。3tnf-调节细胞内皮细胞凋亡血管内皮细胞是机体一类重要的细胞群体,在血管通透性屏障、免疫防御及炎症反应中起着重要的作用。TNF-α是一种主要由活化的单核巨噬细胞系统分泌的炎症介质,对血管内皮细胞有多方面的作用,其损伤作用表现为对血管内皮细胞的直接作用或通过其他细胞因子产生的作用,造成血管内皮细胞形态改变,细胞膜及细胞器损害等。有报道,TNF-α对血管内皮细胞具有直接细胞毒作用,增加内皮细胞的通透性,使内皮细胞间隙增大,可促进单核细胞、白细胞等跨内皮迁移。本研究采用TNF-α作为诱导HUVEC损伤的因素,通过噻唑蓝法测定HUVEC存活率。实验结果表明,在观察的浓度范围内,TNF-α使HUVEC的活性降低,而预先加入20(R)-人参皂苷Rg3干预可提高HUVEC的活性,提示20(R)-人参皂苷Rg3具有抗TNF-α诱导的内皮细胞损伤的作用。内皮细胞的许多功能活动与细胞内钙动员有关,而且内皮细胞活化后产生和分泌的许多血管活性物质又具有钙离子敏感性和钙离子依赖性。钙离子本身可作为一种凋亡信号,调节关键酶诱导的内皮细胞凋亡。TNF-α与细胞膜上的TNF-α受体结合后,通过IP3-钙离子-钙调蛋白激酶途径导致细胞内钙释放和细胞外钙内流,使细胞内的游离钙离子浓度升高。细胞内游离钙离子浓度升高严重干扰线粒体的功能,导致氧化磷酸化过程受损,甚至导致线粒体的结构破坏;激活磷脂酶促进膜磷脂水解,造成细胞膜及细胞器膜受损,同时膜磷脂降解产物花生四烯酸、溶血磷脂等增多亦可导致细胞的功能紊乱;激活蛋白水解酶使自由基生成增加,或通过影响细胞基因的表达,诱发细胞的凋亡或坏死。本实验结果表明,TNF-α能诱导内皮细胞游离钙离子浓度显著增高,导致细胞内钙离子超载,说明TNF-α损伤内皮细胞的作用可能是以钙离子为信使进行细胞间信息传递的,这可能是TNF-α介导细胞损伤的重要机制之一。在本研究中,预先加入20(R)-人参皂苷Rg3能显著抑制TNF-α诱导的内皮细胞内游离钙离子浓度升高,防止细胞内钙离子超载,提示20(R)-人参皂苷Rg3保护血管内皮细胞损伤与其缓解细胞钙超载有关。t-PA和PAI-1是纤溶系统的重要组成部分,t-PA使纤溶酶原激活为有活性的纤溶酶,启动机体的纤溶系统,促使局部血栓溶解;PAI-1是血浆中t-PA的重要生理快速抑制剂,以阻止t-PA启动纤溶系统,而促进血栓的形成和延展。近年研究表明,PAI-1对纤溶系统起着从头抑制的作用,正常情况下,t-PA和PAI-1能够在体内以1∶1的比例形成稳定的复合物,从而维持纤溶系统平衡。目前认为,血管内皮损伤、血浆PAI-1增多是动脉粥样硬化等血管、血栓性疾病发生的主要原因之一。PAI-1表达增高是动脉硬化或原发性高血压疾病出现血液高凝现象的主要原因之一。研究表明,TNF-α能明显增加HUVECPAI-1mRNA表达,说明在TNF-α作用下,PAI-1活性增加是由于HUVEC转录PAI-1基因增强,致使PAI-1蛋白合成增多所致;TNF-α增强HUVECPAI-1活性与mRNA表达,PAI-1活性提高与其mRNA表达增加呈正相关。本研究结果显示,TNF-α20μg/L刺激内皮细胞24h后,t-PA的浓度明显下降,PAI-l浓度则出现显著增高,增多的PAI与t-PA结合,导致局部纤溶系统倾向于血栓形成。这表明TNF-α影响血管内皮细胞的功能主要是增强PAI-1浓度。本研究在预先用20(R)-人参皂苷Rg3干预后,发现20~80μmol/L的20(