银杏内酯b及其前药脂水分配系数测定方法的研究

银杏内酯b及其前药脂水分配系数测定方法的研究

银杏籽是提取银杏叶片的主要有效成分，包括银杏籽a、b、c、j、m等。现代药理研究表明,银杏内酯均是天然的血小板活化因子(plateletactivatingfactor,PAF)受体拮抗剂,其中银杏内酯B(GB)活性最强。此外,GB还具有抗脑缺血、抗氧化、抗菌抗炎、抗过敏和抗休克等作用。药物在体内溶解、吸收、分布、代谢与药物的水溶性和脂溶性密切相关,即和脂水分配系数(logP)相关,尤其是治疗脑部疾病的药物。为增加GB的脂溶性,提高通过血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)的能力,本实验室设计并合成了GB前药(PGB),结构(见图1)。有关银杏内酯及其前药脂水分配系数的测定,文献中未见相关报道。借鉴其它化合物测定方法[9,10,11,12,13,14,15],本文采用摇瓶法及高效液相色谱法(HPLC)测定GB及其前药脂水分配系数,对比二者脂溶性差别,验证结构改性对脂溶性的影响,为后续结构修饰及其它药学研究奠定基础。1试验设备及仪器高效液相色谱仪,配有515高压泵、2420蒸发光散射检测器(ELSD)、2487紫外光谱检测器(UVD)、996二极管阵列检测器(PDA)、Empower数据处理系统(美国Waters公司);MettlerToledoAG135电子天平(德国METTLER公司);HQ45Z恒温摇床(武汉中科科仪技术发展有限责任公司);XW-80A微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);SC2201超声仪(上海小岩工贸发展有限公司);DHG-92021SA电热恒温干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)。GB及PGB(纯度>99%,由农产品生物化工教育部工程研究中心提供);超纯水;甲醇、四氢呋喃、正辛醇、正丁醇、醋酸乙酯(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。2方法和结果2.1gbpgb溶液的配制室温条件下,将正辛醇与二次蒸馏水于恒温摇床中振荡24h至相互饱和,静置过夜分层,两相分离。用正辛醇(二次蒸馏水饱和的)分别配制1.0和0.1mg/ml的GB﹑PGB溶液。上述溶液都应避光保存备用。2.2hplc-uvd法色谱柱为SymmetryShieldTMRP18(3.9mm×150mm,5μm);流动相为GB:甲醇:四氢呋喃:水=28:15:57,PGB:甲醇:四氢呋喃:水=43:15:42(V/V/V);检测器种类及参数:GB:Waters2420蒸发光散射检测器,氮气25psi,漂移管温度55℃,增益100.00%,喷雾器级别60%,PGB:Waters2487紫外光谱检测器,波长288nm;柱温25℃;流速0.8ml/min;进样量10μl。GB甲醇溶液、GB正辛醇溶液、GB饱和水溶液按上述色谱条件进样检测(见图2)。由图2可知,3种溶液GB保留时间均适宜且相互一致,峰形正常,说明此方法适用于GB的脂水分配系数测定。PGB甲醇溶液和PGB饱和水溶液按GB的色谱方法进样(见图3)。由图可知,PGB甲醇溶液中PGB物质峰保留时间适宜,峰形较好;而PGB饱和水溶液在相同条件下未得到对应色谱峰。因此,HPLC-ELSD不适用于测定PGB脂水分配系数。考虑到PGB具有紫外吸收,故可采用HPLC-UVD测定脂水分配系数。对PGB甲醇溶液进行紫外吸收全波长扫描(见图4)。由图可知,PGB在λ=288nm处有最大吸收,选为紫外检测波长,得到PGB饱和水溶液紫外色谱图,检测效果良好。在上述色谱条件下,GB和PGB的保留时间分别为6.990min,9.658min。2.3线性关系及线性回归分析用甲醇分别配制0.5mg/ml的GB和PGB标准母液,并稀释得10,20,50,100,200μg/ml的系列标准溶液。以GB质量浓度C(μg/ml)对数值为横坐标,峰面积A对数值为纵坐标进行线性回归(n=6),得回归方程为:lgA=1.209lgc+3.448,r=0.9989;以PGB质量浓度c(μg/ml)为横坐标,峰面积A为纵坐标进行线性回归(n=6),得回归方程为:A=20357C-32048,r=0.9998。结果表明GB和PGB在10～500μg/ml内呈良好的线性关系。以色谱峰信噪比大于3为标准,在上述色谱条件下GB和PGB的最低检测限为10μg/ml,5μg/ml。2.4进样精密度试验分别取质量浓度为50μg/mlGB甲醇溶液和PGB甲醇溶液,按上述色谱条件连续进样6次,测定计算RSD分别为0.15%、0.89%,均小于药典规定的2%,表明方法精密度符合要求。2.5u3000定了正辛醇溶液中gb含量低且添加量低的原因长分别取10ml0.1mg/ml﹑1.0mg/mlGB正辛醇溶液与10ml二次蒸馏水(正辛醇饱和)混合振荡,振荡时间依次为1,2,3,4,5,7h,每一浓度各处理5瓶。分离水相和脂相,检测水相中GB浓度,当浓度不再增加时,即为平衡时间。结果表明,随着振荡时间延长,水相中GB浓度逐渐增加,但增加有限。由于0.1mg/mlGB正辛醇溶液中GB含量低,在短时间内即可基本完成从脂相到水相的转移。而1.0mg/mlGB正辛醇溶液,振摇5h后,水相浓度RSD=0.45%,说明GB在水相中已达饱和。最终确定平衡时间分别为3～5h。另取10ml0.1mg/mlPGB正辛醇溶液与10ml二次蒸馏水(正辛醇饱和),5ml1.0mg/mlPGB正辛醇溶液与25ml二次蒸馏水(正辛醇饱和)混合振荡,测定不同振荡时间水相中PGB浓度。结果表明,随着两相振荡时间延长,水相中PGB浓度不断增加。0.1mg/mlPGB正辛醇溶液,振摇3,5,7h水相PGB浓度的相对标准偏差为0.58%,表明3～7h水相中PGB浓度基本不变化,反映振荡体系中PGB含量少,两相中的传质过程可较快完成,体系易达平衡状态。1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,振摇时间4-7h,水相中PGB浓度相对标准偏差为0.5%,浓度基本无变化。最终确定平衡时间分别为3h,4h。2.6pgb在水相和脂相中稳定性按2.5方法处理各浓度GB及PGB溶液,振荡至平衡时间后分离两相,于0,2,4,6,8,10,24h分别测定脂相和水相中GB及PGB浓度,计算峰面积或其对数值RSD。结果表明:0.1mg/ml和1.0mg/mlGB正辛醇溶液水相和脂相中GB峰面积RSD分别为1.52%、0.75%和0.91%、1.85%,说明色谱峰面积无明显变化,GB在水相和脂相中24h内稳定。对于0.1mg/mlPGB正辛醇溶液,0-8h水相PGB峰面积RSD=1.49%<2%,而0～10hRSD=9.67%>2%;1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,0～10h水相测定PGB峰面积RSD=1.79%<2%,而0-24hRSD=10.3%>2%,由此可知PGB在水相中至少8h内保持稳定。0-24h,脂相中的PGB峰面积RSD分别为1.40%,1.37%,说明PGB色谱峰面积无明显变化,脂相中24h内测试供试品溶液稳定。2.7正辛醇/水分配系数测定10ml0.1mg/mlGB正辛醇溶液与10ml二次蒸馏水(1∶1),混合25℃振摇3h,10ml1.0mg/mlGB正辛醇溶液与50ml二次蒸馏水(1∶5)混合振摇5h,分离有机相和水相,检测其中GB浓度。其中1.0mg/mlGB分离有机相用甲醇稀释10倍后进样。按下式计算正辛醇/水分配系数,每一浓度平行测定3次。正辛醇/水分配系数计算公式:lgP=lg(CoCw)lgΡ=lg(CoCw),式中:Co表示化合物在正辛醇中的浓度;Cw表示化合物在水相中的浓度。GB测定及计算结果如表1所示。对两个浓度测定结果进行单因素方差分析,F=0.51,而F0.25(1,4)=1.81>F=0.51,由此说明不同浓度对GB脂水分配系数测定结果无明显差异。GB在正辛醇-水溶剂体系中的分配系数为0.59。同法处理PGB溶液,浓度测定及脂水分配系数计算结果如表2所示。对两个浓度测定结果进行单因素方差分析,F=6.38,而F0.10(1,4)=1.81<F<F0.05(1,4)=7.71,可见浓度对PGB脂水分配系数测定结果有一定影响,不同浓度下PGB脂水分配系数测定结果存在一定差异。PGB在正辛醇-水溶剂体系中的脂水分配系数lgP为1.05。2.8影响因素研究2.8.1脂水两相体积比10ml1.0mg/mlGB正辛醇溶液分别按1∶1,1∶5,1∶10(V/V)加入二次蒸馏水混合振摇5h,分离脂水两相,测定GB浓度。脂相用甲醇稀释10倍后进样检测。结果见表3。由方差分析可知,F=147.25,查F分布表知F0.01(2,6)=10.92<F,即脂水两相体积比对脂水分配系数结果有显著性影响。GB正辛醇溶液与二次蒸馏水体积比为1∶1混合,GB从脂相进入水相,实现传质过程,由于二次蒸馏水体积小,传质平衡前GB在水相中已达过饱和状态,剩余GB无法进入水相而留存于正辛醇中。GB正辛醇溶液与二次蒸馏水按体积比1∶5和1∶10混合,GB在两相中可达分配平衡,在水相中仍未达饱和状态,测定结果均准确。但取等量GB正辛醇溶液实验,后者正辛醇饱和的二次蒸馏水耗量增加一倍,故确定GB正辛醇溶液与二次蒸馏水的体积比为1∶5。2.8.2脂水分配系数测定实验中发现分离脂相待测液采用不同稀释溶剂及稀释比例,PGB色谱峰的峰形和保留时间差别明显。分别用正辛醇、正丁醇和甲醇10倍稀释1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,相同色谱条件下进样检测,结果表明甲醇、正丁醇、正辛醇稀释样PGB色谱峰保留时间逐一缩短,分别为9.292,9.075,7.115min,并且峰形差异较大。说明采用不同溶剂稀释脂相,将改变体系中PGB状态,并最终影响其脂水分配系数的检测结果。有关溶剂影响PGB脂水分配系数测定的机理还有待进一步实验研究。用甲醇按不稀释、10倍和50倍稀释1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,HPLC-UVD检测。结果如表4所示。PGB正辛醇溶液随着稀释倍数的扩大,保留时间延迟,峰形适宜,峰面积相差较小(RSD=2.2%)。选择正辛醇为脂相溶剂,可模拟生物膜相测定药物脂水分配系数。实验操作发