反刍动物瘤胃亚急性酸中毒的研究进展

反刍动物瘤胃亚急性酸中毒的研究进展

肿瘤胃酸中毒是现代仰光反应中常见的营养成分疾病。随着畜牧业逐步向集约化和高效化发展,在现代奶牛生产、肉牛和肉羊育肥过程中,为了提高生产效率而大量饲喂以谷物淀粉为主要能量饲料的高精料饲粮,在生产水平提高的同时,导致以瘤胃酸中毒为主的代谢性疾病的发病率提高,这已经成为现代反刍动物生产中的突出问题。即使在欧美发达国家,瘤胃酸中毒也已成为奶牛场和肉牛育肥场关注的主要问题,北美地区每年奶牛产业因瘤胃酸中毒损失5亿~10亿美元。我国高产奶牛的饲养以及肉牛和肉羊后期肥育生产中也经常发生瘤胃酸中毒。由于我国的优质粗饲料资源较北美和欧洲缺乏,饲喂牛和羊的粗饲料质量普遍较差,除了规模较大的奶牛场从国外进口苜蓿等优质粗饲料饲喂奶牛外,在大部分地区仍主要以农作物秸秆作为饲养牛、羊的主要粗饲料来源,生产者为了追求较高生产性能,生产中不得不大量使用富含淀粉的谷物精料来满足动物的营养需要,动物对优质纤维的采食量不足,结果使高产奶牛及强度育肥的肉牛和肉羊发生瘤胃酸中毒的情况普遍存在,该疾病的发病率呈逐年上升的趋势。瘤胃酸中毒营养代谢病的发生不仅会影响奶牛的采食量和产奶量,而且会导致瘤胃微生物区系平衡而使瘤胃对饲料的消化和代谢能力的下降,并伴随有拉稀、消化道上皮损伤和炎症、蹄病、肝脏脓肿和乳脂下降综合征等病征,给养殖业带来很大损失,已经成为制约我国奶牛、肉牛生产的重要因素之一。正常情况下,反刍动物瘤胃内pH维持在6.5~7.5,若长期饲喂高精料饲粮或突然采食大量谷类等易于发酵的碳水化合物饲料,则瘤胃出现代谢紊乱,瘤胃中短链脂肪酸和乳酸积累,致使pH不同程度地下降,即可能诱发代谢性瘤胃酸中毒。同时,由于高精料饲粮诱发瘤胃微生物区系改变,伴随发生了瘤胃代谢途径的显著变化。瘤胃酸中毒一般分为瘤胃急性酸中毒和瘤胃亚急性酸中毒(sub-acuteruminalacidosis,SARA,也称慢性酸中毒或亚临床酸中毒)2类。一般认为,瘤胃内pH在5.2~5.6发生SARA;pH低于5.0即发生急性酸中毒。发生瘤胃急性酸中毒动物会表现出较明显的临床征状,易于发现并及时防治。与瘤胃急性酸中毒相比,SARA一般没有明显的临床征状,目前没有适宜的诊断手段,因而更具有隐蔽性和隐患性。尽管国内外学者对SARA进行了大量研究,但过去多数的研究集中在瘤胃中单一代谢产物的研究,而对瘤胃微生物的综合代谢特性研究不够,对其发病的微生物学和营养代谢机理缺乏深入而系统地研究,甚至不同学者提出的对SARA的发生机制的学术观点也存在争论。因此,“反刍动物SARA的发生和调控机制”是重要的科学问题,进一步深入研究不仅在学术上有重要意义,而且对集约化奶牛、肉牛和肉羊生产中有效降低经济损失具有重要现实意义。1肿瘤胃酸形成机制1.1材料论及并发症国际上已有一些关于瘤胃酸中毒发生机制的研究报道,对瘤胃酸中毒发生提出3种学说。目前多数学者认同“乳酸中毒学说”,有部分学者认同“有机酸[主要是挥发性脂肪酸(VFA)和乳酸]中毒学说”,也有学者认同“内毒素和组织胺中毒学说”。1.1.1瘤液phvfa瘤胃有机酸积累中毒学说认为瘤胃酸中毒是由于动物采食的大量可溶性碳水化合物在瘤胃内代谢所产生的VFA浓度增加,导致瘤胃液pH大幅度下降所致,而不是由于瘤胃液中乳酸大量积累的缘故。瘤胃液pH高于5.5时,其间乳酸积累较少甚至没有。因此,瘤胃液pH曾经被认为是诊断SARA的主要方法。国际上普遍认为:当瘤胃液pH降低到5.2~5.6之间,并至少每天维持3h以上时间,或者pH低于5.8即发生SARA。多数学者研究发现,患有SARA的奶牛瘤胃乳酸浓度较低(<5mmol/L),瘤胃液pH的下降主要是由VFA浓度的增加引起,乳酸并不是瘤胃液pH下降的主要因素。大量研究表明,瘤胃液pH不是SARA的唯一可靠指标,而且由于瘤胃液pH会受到采样方法、采样时间和采样部位的影响而有较大变化,近年来,国际学术界一直在探讨新的、更为有效的指标。1.1.2乳酸利用菌的产生有些学者认为,瘤胃内微生物紊乱,特别是乳酸产生菌与乳酸利用菌之间的菌群失调导致瘤胃内乳酸积累是诱发瘤胃酸中毒的直接原因。乳酸产生菌主要有溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisovens)、牛链球菌(Streptococcusbovis)、乳酸杆菌(Lactobacillus)等;乳酸利用菌主要有反刍兽新月单胞菌(Selenomonusruminantium)、埃氏巨形球菌(Megasphaeraelsdenii)等。二者之间的平衡状态决定了瘤胃中乳酸的积累程度,当反刍动物摄入大量可溶性碳水化合物后,几乎所有瘤胃微生物均加速生长。牛链球菌在诱发瘤胃急性酸中毒中至关重要,该菌在不同的pH条件下所代谢的产物不同,当pH低于5.7时,则激活该菌的乳酸脱氢酶(LDH)活性,同时抑制其丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)的活性,将以乳酸为代谢终产物。当pH高于6.0时,其快速繁殖的代谢产物是乳酸,而缓慢生长则以产乙酸、甲酸和乙醇为主;因乳酸的电离常数(pKa,为3.9)远低于VFA(pKa为4.8),所以瘤胃中乳酸对pH的贡献大于VFA。同时,乳酸的产生有可能促进VFA的吸收;大部分乳酸可被乳酸利用菌(反刍兽新月单胞菌和埃氏巨形球菌)代谢转化为VFA,然而,当瘤胃液pH低于5.0时乳酸利用菌受到抑制,乳酸的产量超出利用量而造成乳酸积累。可见,瘤胃中的乳酸和VFA之间有互作效应。1.1.3内毒素的变化内毒素和组织胺中毒学说认为当饲粮中大量可发酵碳水化合物进入瘤胃时使其内环境发生剧变,瘤胃内微生物区系发生改变,pH急剧下降,结果导致纤维素分解菌数量下降,革兰氏阴性菌大量死亡崩解,释放出大量内毒素和组胺并被吸收入血,肝脏和外周血液中的内毒素水平升高,形成内毒素血症型酸中毒。另有研究表明,当发生酸中毒时,一方面,瘤胃内的细菌内毒素水平远高于正常时的水平;另一方面,胃壁黏膜发炎、损伤,肝脏受损,网状内皮系统对内毒素的解毒能力受到破坏,致使内毒素进入血液,而导致微循环障碍而发生缺氧,从而使糖代谢过程沿着无氧酵解途径进行,结果形成大量乳酸,因此,乳酸和细菌内毒素可能对瘤胃酸中毒的发生起到相辅相成的作用。另外,乳酸积累及pH的缓慢下降还可能促进上皮释放产生降解组织的金属蛋白酶,这些金属蛋白酶进入血液还将导致动物发生蹄叶炎,出现跛行、甚而蹄甲脱落等征状。瘤胃内组胺的吸收不仅使全身组织胺含量上升,还可进一步加重由乳酸中毒引起的瘤胃上皮细胞的损伤,是使酸中毒病情恶化的主要因素。由SARA引起牛消化道黏膜和肝脏发生炎症时,在肝脏门静脉血和外周血中检测到标记物淀粉A(SAA)和结合珠蛋白(Hp)含量显著增加。1.2饲料及饲粮中ndf含量对瘤胃羧酸损害的影响正常情况下,瘤胃内有机酸的产生和利用保持同步与平衡,中和酸度主要通过唾液分泌、瘤胃上皮吸收有机酸、瘤胃液外流稀释和代谢的途径来完成。SARA的发生与动物饲粮的类型及其碳水化合物组成有非常密切的关系。影响SARA的另一个重要因素是瘤胃的缓冲能力,瘤胃缓冲能力受内源因素和饲粮因素2方面影响。内源缓冲能力主要由动物的唾液分泌量决定;饲粮缓冲能力主要由饲粮的中性洗涤纤维(NDF)水平和阴阳离子差(DCAD)值决定。国内外学者在饲粮结构,特别是碳水化合物类型对瘤胃微生物代谢以及SARA的发生上进行了大量研究,普遍认为保持瘤胃微生物区系的稳定是维持瘤胃健康的关键所在。不同类型的碳水化合物饲料在瘤胃中的发酵速度不同,如可溶性糖、淀粉、半纤维素及纤维素被降解的时间分别为12~25min、1.2~5h、8~25h、24~96h。即使是同类型饲料其代谢的时间与方式也不尽一致,如小麦淀粉和马铃薯淀粉的降解速率分别为每小时34%和5%;软粒小麦比硬粒小麦在瘤胃内发酵产生的乳酸少。可见,饲料中碳水化合物在瘤胃中的降解速度可改变瘤胃微生物区系,并对瘤胃微生物代谢途径产生影响。饲粮中NDF水平在很大程度上影响瘤胃健康,同时饲料的物理与化学特性在很大程度上影响动物的咀嚼与反刍时间,从而与SARA的发生有关。Mertens提出了物理有效纤维(peNDF)的概念,将饲粮中纤维长短与动物咀嚼能力和反刍次数相联系,peNDF水平太低或饲料颗粒太小也是引起瘤胃酸中毒的重要因素。饲粮中淀粉含量大于28%(干物质基础)、精粗比例大于55%、饲粮纤维含量太低(如NDF小于25%和来源于粗饲料的NDF小于19%时)均可引发瘤胃酸中毒。Plaizier在综述中提出饲粮中peNDF水平低于12.5%(干物质基础)时就会发生SARA。在NRC(2001)奶牛营养需要中提出用饲粮中非纤维性碳水化合物与中性洗涤纤维比例(NFC/NDF)作为评价奶牛饲粮中碳水化合物平衡的标准,并且要求奶牛饲粮中75%的NDF应来源于粗饲料,饲粮中最高NFC水平不超出44%,以保证饲粮peNDF的充足供应。在奶牛和肉牛的饲养实践中,美国等许多发达国家在奶牛饲粮配制方法上推广使用全混合日粮(TMR),以保证饲粮中的peNDF水平,最大限度地预防SARA的发生。1.2.2硫假物添加量sara对乳状液质及瘤胃菌群结构的影响当高精料饲粮诱发奶牛发生SARA时,其瘤胃微生物区系发生显著变化,与饲喂常规饲粮奶牛相比,发生SARA的奶牛瘤胃液中牛链球菌和乳酸杆菌数量分别提高3.62%和4.65%,溶纤维丁酸弧菌和埃氏巨型球菌的数量分别降低1.14%和4.90%。在高精料饲粮条件下奶牛发生SARA,同时发现由于高精料型碳水化合物结构饲粮致使pH降低导致瘤胃菌群结构失衡;瘤胃上皮乳头出现肿大,角质层脱落等异常状态。硫胺素可通过抑制牛链球菌和乳酸杆菌等乳酸产生菌的生长,促进埃氏巨型球菌的生长而调节瘤胃菌群结构的平衡而从根本上缓解瘤胃酸中毒。经研究发现,添加硫胺素可通过改善瘤胃发酵、调节瘤胃菌群结构和瘤胃内酸度平衡而缓解SARA;添加120mg/kg的硫胺素具有促进犊牛生长发育和瘤胃上皮发育的作用。因瘤胃中原虫能吞噬淀粉或吞噬细菌而使淀粉与产乳酸细菌分离,避免饲粮中淀粉被快速降解,纤毛原虫(如内毛虫)能较好地适应高精料饲粮而在维持瘤胃液酸度平衡中发挥重要作用。1.2.3瘤胃羧酸机制的研究反刍动物瘤胃微生物在对营养物质进行消化代谢时存在着复杂的共生、竞争关系。不同种类瘤胃微生物之间的互作在SARA发生过程中起重要作用,采用群体感应(quorum-sensing,QS)技术可揭示微生物细胞间的信号转导机制。目前,研究发现群体感应在微生物毒素分泌、生物膜的形成和次级代谢产物的生成等生理生化过程中发挥了重要作用。至今,已经发现多种QS信号分子,其中研究较为深入的有N-酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserinelactones,AHLs)、自诱导肽(AIPs)和自体诱导物-2(AI-2)3大类。AHLs为群体感应体系的基础指标,特别是在与动物相联系的革兰氏阴性菌中广泛存在。已有研究表明,瘤胃内存在多种AHLs信号分子,但是瘤胃微生物信号分子种类及其对营养物质消化代谢的调控作用鲜有研究报道。因此,可以预见AHLs信号分子是揭示瘤胃酸中毒机制的有效标记物之一。代谢组学(metabonomics)作为一种借助氢核磁共振(1H-NMR)和质谱仪等高通量、高灵敏度、高精确度的现代分析技术,已发展成为研究解读动物和人体机体复杂代谢机制的有力工具。代谢组学一般是研究小分子代谢产物,主要包括定量检测生物内源性代谢产物,由此挖掘代谢产物的整体变化规律,并将这些变化规律与机体所发生的生物变化或过程相关联以揭示其变化的本质。其主要特征是高通量检测和大规模计算,从生物系统全面综合地机体的代谢变化规律。近年来,基于核磁共振和质谱技术的代谢组学在奶牛中进行大量研究,为揭示奶牛饲粮组成对奶牛生产性能和乳品质的影响机理提供了新思路。研究重点集中在瘤胃代谢组、牛奶代谢组以及血液代谢组的研究。Saleem等采用核磁共振(NMR)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、二级质谱联用(DFI-MS/MS)以及脂类组学综合技术对瘤胃瘘管采集的64份瘤胃液样品进行了分析,构建了246种代谢小分子的瘤胃液代谢数据库,并找到它们与饲粮类型之间的关系。Sundekild等对456头丹麦荷斯坦奶牛和436头娟姗牛的奶样进行了NMR组学分析,得到的代谢轮廓与牛奶中体细胞数之间呈强相关,在体细胞数较高的奶样中发现乳酸、丙酸、丁酸、异亮氨酸、β-羟丁酸含量较高,而在体细胞数较低的奶样中马尿酸和延胡索酸含量较低。Forano等用NMR技术研究了高纤维饲粮条件下瘤胃中琥珀酸丝状杆菌对碳水化合物代谢的影响。Ametaj等应用营养代谢组学技术研究了饲喂不同比例谷物精料对奶牛瘤胃酸中毒的影响,进一步探讨瘤胃微生物代谢产物参与宿主的代谢过程及其对宿主健康和疾病的作用。可见,SARA是机体内营养失衡导致体内正常的代谢平衡失调的结果,用某些单一的代谢产物作为研究对象往往不能全面反映整体代谢过程。运用代谢组学技术来研究瘤胃酸中毒问题,可以从代谢水平上研究营养素与瘤胃微生物的相互作用和SARA的发生、发展及其对机体整体代谢的影响。2肿瘤胃中毒的预防2.1改善瘤胃羧酸的ph和微生物区系饲养管理不当譬如动物饥饿后自由采食、突然改变饲粮、饲养制度不合理、改变饲粮缺乏适应期均易引发瘤胃酸中毒。维持瘤胃内pH和微生物区系稳定是预防瘤胃酸中毒的最有效途径。饲喂次数及每次饲喂量是控制SARA的重要措施。Allen认为,在饲喂后瘤胃液pH降低,且降低程度随饲喂量的增加和饲粮NDF水平的降低而增加。饲喂TMR可避免动物一次性采食大量谷物,因此较单独饲喂某种饲粮成分或营养不平衡饲粮能降低患SARA的风险。饲喂TMR还可严格控制动物实际采食的精粗比。2.2如何控制饲粮中的nfc瘤胃酸中毒主要是由于突然采食过量的极易发酵的碳水化合物饲料而引起的。因此,选择适当的谷物饲料对预防瘤胃酸中毒有积极的意义。通过合理的配制饲粮,可以提高瘤胃的缓冲能力,有利于预防SARA。对反刍动物饲粮中能量和纤维成分进行适当的调节,饲粮NDF水平与瘤胃有效容积正相关,与饲粮能量水平负相关,在配制饲粮时应控制NDF占TMR的百分比。NRC(2001)推荐采用饲粮NDF最低水平为25%,其中至少75%来自长且粗糙的饲草,从而有足够的纤维以刺激咀嚼、反刍和唾液的产生,有助于瘤胃微生物的发育。通常,以每天保证供给奶牛4~5kg优质青干草为宜。青贮玉米是反刍动物中常用的粗饲料,然而饲喂大量青贮玉米比饲喂干草会增加患SARA的可能性。因此,在生产中要控制青贮玉米在饲粮中的比例。预防瘤胃酸中毒应控制饲粮中NFC的水平和种类。饲粮中的NFC包括有机酸、糖类、淀粉以及可溶性纤维。Hall等提出,在满足有效纤维需要量时,NFC以干物质为基础的最佳组成为:糖类0.5%,可溶性纤维10%,淀粉20%。不同加工处理方法影响饲粮中碳水化合物的发酵程度及发酵速率,也影响饲粮最佳NFC水平。Mertens推荐使用peNDF控制饲粮纤维水平。泌乳奶牛饲粮peNDF水平不能低于15%(干物质基础),肉牛饲粮中的peNDF水平不能低于19%(干物质基础)。2.3乳酸菌接种的效果直接饲喂微生物能够有效控制SARA的发生。使用乳酸菌能有效预防瘤胃乳酸的积累而造成的瘤胃内pH升高。然而,直接接种乳酸菌产生的效果可能不同。虽然直接接种乳酸菌会促进乳酸利用,但是长期添加的效果不太理想,因为乳酸菌在瘤胃内存活的时间太短,不能产生长期的效果。2.4酸质细度的增加酸中毒是瘤胃中有机酸积累过多造成的,因此在饲粮中添加一定量的缓冲物质则能够起到稳定pH作用。目前,最常用的措施是在饲粮中直接添加碳酸盐等缓冲剂。可通过提高瘤胃液的流速、中和瘤胃产生的部分有机酸或者2方面结合来发挥缓冲效应,达到阻止瘤胃中有机酸的积累,预防瘤胃酸中毒的目的。生产中以碳酸氢钠和氧化镁混合缓冲剂最常用。碳酸氢钠的推荐用量:占饲粮干物质总量的0.6%~1.0%(每头100~230g/d);氧化镁的推荐用量:占饲粮干物质总量的0.3%。用两者的混合物时2~3份碳酸氢钠与1份氧化镁混合,其添加量占饲粮干物质总量的0.6%~0.8%或占精料干物质总量的0.8%~1.2%。尽管添加缓冲剂在缓解瘤胃酸中毒方面发挥了一定作用,但是,长期在饲粮中添加使用会影响到机体酸碱平衡和阴阳离子平衡而有负面效应。2.5离子类载体药物饲粮中添加抗生素能有效抑制产乳酸菌的生长,从而控制乳酸的产量。离子载体类抗生素(拉沙里菌素和莫能菌素)的使用证明抗生素能有效防止瘤胃酸中毒。莫能菌素(又称瘤胃素)是目前反刍动物肥育过程中使用最广泛的一种离子类载体抗生素。大量研究表明,它能有效降低甲烷的产生量、乙酸与丙酸比例,还能抑制瘤胃内牛链球菌的活动,减少乳酸的产生量来提高瘤胃液pH,减少了瘤胃酸中毒的发生。在瘤胃内接种乳酸利用菌(埃氏巨型球菌)可提高瘤胃内乳酸利用率,并能与牛链球菌竞争性争夺葡萄糖、麦芽糖等底物,抑制牛链球菌的生长。实际生产中,精料中添加30mg/kg莫能菌素可降低瘤胃酸中毒的发病率。然而,许多国家已经禁止将抗生素作为饲料添加剂,并且消费者普遍对饲粮中添加抗生素的动物产品有质疑。所以寻找替代抗生素的改善瘤胃发酵的物质已经成为近年的研究热点。2.5.2瘤胃羧酸检测埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)可与牛链球菌竞争性争夺葡萄糖、麦芽糖等底物,抑制牛链球菌的生长。因此,一些研究表明,瘤胃内接种该菌具有减轻瘤胃酸中毒的效果。Robinson等向瘤胃接种2×1012~3×1012个埃氏巨型球菌407A,瘤胃中乳酸浓度显著下降,pH升高,瘤胃酸中毒减轻。Hibbard等报道,饲粮中精料水平从50%陡增至90%时,肥育牛换料前经口腔灌注埃氏巨型球菌,能显著提高采食量,减轻瘤胃酸中毒的发生。2.5.3促进反液压兽月型单胞菌回复突变的中间产物反刍兽新月单胞菌是能有效利用乳酸的细菌,饲粮中添加有机酸,可使反刍兽新月单胞菌的生长速度和利用乳酸的能力均有不同程度的提高。电子受体可促进该菌利用乳酸的的能力。苹果酸、延胡索酸和琥珀酸等是瘤胃内重要的电子受体,是瘤胃微生物发酵生成丙酸的中间产物。丙酸的生成有多种途径:当反刍兽新月型单胞菌利用乳酸发酵时,通过琥珀酸脱羧基途径产生丙酸,这是乳酸发酵的主要途径。延胡索酸和苹果酸及其酸盐可促进反刍兽新月型单胞菌等对乳酸的发酵,在瘤胃内乳酸盐的代谢和丙酸盐的合成中起着至关重要的作用。有学者发现,添加苹果酸和延胡索酸不仅能有效地促进反刍兽新月单胞菌利用乳酸的能力,使VFA产生量下降,同时增加了发酵终产物二氧化碳的浓度。与抗生素相反,苹果酸等有机酸是通过促进而不是抑制瘤胃微生物的生长而减少SARA的发生,同时它们作为代谢途径的中间产物,可被微生物或其他生化反应所代谢利用,无残留,不存在微生物耐药性选择、病原体抗药性转移和药物残留等问题。因此,有机酸是调控瘤胃乳酸发酵和抑制瘤胃酸中毒发生中有应用潜力的调控剂。2.6尿素对药物代谢及酶系统的影响瘤胃酸中毒发生可使瘤胃及血液中组胺、内毒素和硫胺素酶水平增加。添加硫胺素可能起到调控作用而缓解瘤胃酸中毒。硫胺素调控瘤胃酸中毒的机制是促进酸利用菌及硫胺素合成菌的生长,抑制乳酸产生菌及淀粉分解菌的繁殖,促使瘤胃微生态恢复平衡。董淑红等研究表明,诱导山羊发生SARA后,饲粮中添加硫胺素组硫胺素酶活均显著低于未添加组,且硫胺素酶活性比对照组显著降低;同时,添加硫胺素组的组胺水平显著或极显著低于不添加硫胺素组;此外,硫胺素也可降低瘤胃液和血液中内毒素水平。潘晓花等研究发现添加硫胺素可通过改善瘤胃发酵、调节瘤胃菌群结构和瘤胃内pH平衡而缓解SARA;添加120mg/kg的硫胺素具有促进犊牛生长发育和瘤胃上皮发育的作用。2.7给药及预防瘤胃羧酸牛链球菌和乳酸菌是瘤胃酸中毒的主要诱发菌,接种二者的疫苗则可刺激机体产生抗体,从而减少乳酸的产量和瘤胃酸中毒的发生。是生产中预防瘤胃酸中毒的有效途径之一。Shu等报道,给牛接种牛链球菌5(S.b