奶牛早期妊娠诊断方法的研究进展

奶牛早期妊娠诊断方法的研究进展

在喂食（或母乳喂养）后不久，应进行初步诊断，以加强母乳喂养的管理，确保顺利分娩，及时调整母乳喂养，缩短产仔间差，提高繁殖效率。生产实践中广泛应用的直肠检查等方法,尽管简单易行,不需特殊设备,但检出时间长,判断结果不够准确,影响奶牛及时配种,因此奶牛早期妊娠诊断方法研究引起了普遍重视。近30年来奶牛早期妊娠诊断方法研究发展很快,新的诊断方法不断问世,其总的趋势是向着快速、简便、经济方向发展。1超声多普勒仪检测宫血音超声波诊断法是把超声波的物理特点和动物组织结构的声学特点密切结合的一种物理学诊断法。它是以高频声波对奶牛的子宫进行探查,然后将其回波放大后以不同的形式转化成不同的信号显示出来。应用的超声波诊断仪主要有A超、B超和多普勒超声(D超)三种,以多普勒超声应用常见。80年代末国产兽用的超声多普勒仪和仿制的A型测孕报警仪问世后开始应用于奶牛妊娠诊断研究。郑星道等(1988)采用SCD—Ⅱ型兽医用超声多普勒检测仪对483头乳牛进行了早期怀孕诊断,最早探测宫血音、胎心音、胎血音的时间分别为16d、50d、59d,宫血音在配种后16～30d、31～50d的符合率分别为92.93%(184/198)、97.91%(141/144),配种后51～79d及未怀孕的符合率分别为100%(116/116)、100%(36/36);胎血音在配种后59～65d、70～85d的符合率分别为48.15%(13/27)、90.35%(25/27)。试验证明,检测宫血音的时间比胎心音、胎血音提前30～40d左右,并与直肠检查法相比较,其符合率高,因此乳中的早期怀孕诊断可用宫血音作为判定怀孕的主要依据。陈兆英等(1990)应用超声多普勒仪从直肠探查宫血音,诊断奶牛中后期妊娠的结果与直肠检查的全部符合,证明这种方法不仅可以用于妊娠早期的奶牛,也可在奶牛怀孕的中后期供诊断之用。马群山等(1999)用DRS超声波仪对配种后21～45d的62头母牛进行妊娠诊断,与直肠检查法比较,妊娠符合率为98.04%,空怀符合率为72.73%(8/11)。张寿等(1999)应用SCD-Ⅱ型兽用超声多普勒仪检查宫血音,对51头受配乳牛进行了早期怀孕诊断,并与直肠检查结果进行验证,结果20～30d、31～60d、61～75d的符合率分别达86.7%、100%和100%。对12头未孕牛检测的符合率为100%。B超由于仪器价格较高,体积较大,在猪、羊妊娠诊断中有一些报道,在奶牛妊娠诊断中仅见邓干臻等(2004)使用实时B超法对不同妊龄的137头黑白花奶牛进行了妊娠检查,早期妊娠检查声像图主要表现为妊囊和/或胚斑,探查到其中之一者即可确诊为妊娠,配种后26～30d妊娠检查确诊率高达88.9%,高于50日龄左右的直肠检查;配种后31～35d时的确诊率为97.2%,配种后35d以上者,确诊率均达到100%。B超诊断法快捷、简便、准确率高,对早期妊娠以实时图像显示,具有客观性,是一种良好的早期妊娠诊断法。靳智勇(2008)应用兽用超声多普勒仪对80头奶牛进行了早期妊娠诊断,并与直肠检查结果进行分析比较,其结果:配种后25～39d、40～60d和61～80d采用超声多普勒仪诊断的符合率分别为84.0%、97.1%和100%;对8头未怀孕的奶牛检测符合率为100%,总符合率为93.8%。结果表明,应用超声多普勒仪检测宫血音进行奶牛早期妊娠诊断效果明显。与直肠检查相比,超声波诊断法操作简便,容易掌握,省时省力,仪器价格不高,可以完全取代奶牛场中沿用已久的直肠检查法。2妊娠合并血小板的超早期妊娠诊断母畜怀孕后的受精卵,特别是桑椹胚将产生一类乙酰化的甘油磷脂,即血小板活化因子(PAF)。PAF将引起不依赖于ADP释放和产生四烯酸代谢的血小板凝集,特别是胚胎性PAF能够介导妊娠母体对胚胎的识别,而引起母体妊娠的最初反应———血小板减少。O’Neill(1985)发现在小鼠早孕期外周血小板计数明显减少,是母体对妊娠识别的最初全身性反应。陈学峰等(1998)对20头未孕母牛血小板正常值的测定结果为(496.5±66.5)×109/L,对30头受配母牛进行血小板值变化和最佳血检时间的试验,结果表明,22头妊娠母牛于配种后第7天血小板值明显减少,而8头未妊娠母牛则无明显变化。根据妊娠母牛配种前后血小板值差>192.3×109/L为妊娠标准,对30头受配母牛进行超早期妊娠诊断试验,经直检妊娠母牛符合率为86.36%,空怀母牛符合率为87.5%。马群山等(2000)根据配种前血小板的平均值536×103/mm3与配种后第7天血小板降到最低的平均值411×103/mm3之差等于或大于70×103/mm3作为判定妊娠的标准,对198头母牛进行早期血小板计数妊娠诊断,与直肠检查法比较,其妊娠和空怀的符合率分别为80.67%(96/119)和89.87%(71/79)。李助南等(2005)应用血小板计数法对奶牛超早期妊娠进行诊断,结果表明:20头未孕母牛的血小板测定值为(494.9±6.9)×109个/L,与之相比,22头妊娠母牛的血小板测定值极显著减少(P<0.01);根据妊娠母牛配种前后血小板值之差大于或等于194.8×109个/L为妊娠标准,对30头受配母牛进行了超早期妊娠诊断,经与直检结果比较,妊娠母牛符合率为86.36%(P>0.05)。采用血小板计数法进行奶牛早期妊娠诊断具有时间早、方法简单,易学易用,准确率高等优点,值得推广应用。3采用硫酸铜法或玫瑰花环抑制试验方法,主要考1974年,Morton在小鼠血中发现早孕因子(EPF)。Koch(1983)报道,母牛受孕后不久,乳和血清中会出现EPF。EPF是一种妊娠依赖性多分子蛋白质复合物,是一种新的妊娠特殊蛋白,是妊娠早期血清中最早出现的一种免疫抑制因子,它通过抑制母体的细胞免疫而使胎儿得以在母体内存活,免受免疫排斥,因此EPF被认为是与早期妊娠相关的物质,所以它是早期妊娠诊断的一项重要指标。EPF可通过硫酸铜法和玫瑰花环抑制试验进行测定。硫酸根可使早孕因子发生凝集,用定性分析乳中早孕因子含量,从而达到早期妊娠诊断的目的。取常乳和末把乳各1mL于玻璃平皿中,滴入1～3滴3%硫酸铜溶液并迅速混合均匀,呈现云雾状沉淀者为阳性,反之为阴性。配种后16～35d内为最佳检乳时期,早、中、晚3个时间采集的奶样,以中午乳汁检查与直检对照的符合率最高。将常乳和末把乳同时检测其符合率较高(朱顺国,1991)。郑昌乐等(1990)用硫酸铜法对160头奶牛进行试验,乳检与直检相对照,阳性总符合率为87.8%,阴性总符合率为79.3%。王应安等(1996)采用硫酸铜法对人工授精后16～40d的74头荷斯坦牛的124份乳样进行早期妊娠检测,结果与人工授精后40～60d经直肠触诊结果核对,阳性符合率为88.37%,阴性符合率为87.09%。何勇军等(2001)对21头奶牛试验,3%硫酸铜法对于怀孕牛和未怀孕牛的检出率分别为70%和63.6%,认为作为一种辅助诊断方法是基本可行的。试验选用的奶牛头数较少,致使试验结果较前人做的略低。李青旺等(2004)采用3%和5%硫酸铜液对57头黑白花母牛进行早期妊娠诊断,通过直肠检查确诊,结果3%硫酸铜液乳检的总阳性率为87.14%,5%硫酸铜液乳检的总阳性率为84.8%。硫酸铜法对奶牛早期妊娠诊断的符合率较高,方法简便、快速,易操作,药品来源广泛,价廉,适合牛舍现场操作,在奶牛场可作为一种早期妊娠诊断的常规方法应用。1981年,澳大利亚科学家开始利用玫瑰花形抑制试验(PIT)进行早期妊娠诊断试验。在这项试验中,把母亲的淋巴细胞与来自另一种动物的红细胞(RBC)混合,淋巴细胞自然地呈玫瑰花形。来自怀孕母体的淋巴细胞组成的花形比未孕的要少。牛在空怀时玫瑰花环抑制滴度(RIT)的范围为6～10,妊娠时范围为2～18;绵羊的上述指标依次为8～10和12～26;猪依次为7.12±0.84和17.5±1.4。依据其RIT的高低就能在配种后数小时至数天内对牛、羊、猪作出超早期妊娠诊断或受精检查。由于EPF在授精后数小时内出现,而且在胎儿死亡或排出后很短时期内即消失,所以测定EPF除作为早期妊娠诊断外,还可作为妊娠后期胎儿存活的指示物。李雅茹等(1988)应用玫瑰花环抑制试验对66头奶牛试验表明,妊娠和未妊娠总检出率为87.9%(58/66)。通过玫瑰花环抑制试验测定EPF分析法灵敏且不要很多仪器,但费时较长,不适合大批样本检测,因此尚不能作为常规的妊娠检查方法在实践中广泛应用。Walter(1994)研究出奶牛EPF的ELISA测定法,对授精后24h的奶牛进行妊娠诊断,准确率为87.5%,但对未孕牛的误差较大。向际尧等(1995)从孕牛血中提取了分子量为44Kda的EPF,并具有较高活性。开展EPF的研究对家畜繁殖具有较大理论意义和实践价值,可以通过制备单克隆抗体药盒将玫瑰花环抑制试验发展成放射免疫分析法或放射受体分析法测定EPF,研究出一种简便、准确、灵敏、快速的免疫试验方法,加快在家畜繁殖领域进行是否已受孕的超早期诊断(王建辰等,1998)。4对白花奶牛的妊娠和空怀诊断结果妊娠母牛在胚胎快速生长的过程中,机体产生一种特有的免疫球蛋白,它在酸性环境中具有与其他蛋白质形成低溶性复合物(絮状物)特性,据此可以对奶牛进行早期妊娠诊断。方法是采取配种后16～45d的母牛血清(由静脉采血)0.5mL于小烧杯中,加入0.2mol盐酸7.5mL,用磁力搅拌器混合1～2min,再用13%硝酸滴定至pH0.68,滴定时间不少于5min。然后将此溶液立即倒入试管内静置20min,在透射光下观察反应,呈乳白色絮状物或乳黄色絮状物者为阳性(妊娠),呈乳白色或无色透明者为阴性(未妊娠)(王念功等,1989)。安翠华等(1994)对配种后16～45d的母牛用血清酸滴定法进行早期妊娠诊断,准确率达95.98%。何宝祥等(1997)对人工授精后16～45d的68头奶牛的89份血清经血清酸滴定法检测,与直肠触诊结果核对,诊断的准确率妊娠牛为88.88%(32/36),非妊娠牛为90.57%(48/53)。马群山等(1999)对配种后16～45d的381头黑白花奶牛进行早期妊娠诊断试验,经配种3个月后直检,妊娠和空怀的符合率分别为97.48%(310/318)和84.13%(53/63),总符合率为95.28%(363/381)。郑毛亮等(2007)应用血清酸滴定法对黑白花奶牛进行早期妊娠诊断研究,妊娠的符合率为90.91%(210/231),未孕的符合率为93.42%(71/76),总符合率为91.53%(281/307)。该法具有诊断时间早、方法简单、结果准确、设备廉价、易操作判定等特点,适合基层单位在生产实践中应用。5牛奶早期妊娠和妊娠检测方法及应用放射免疫测定法(RIA)是一种将同位素的放射测量与免疫反应原理相结合的微量分析方法。1971年Laing等首次将RIA用于牛乳中孕酮(P4)的测定,并证明乳中P4浓度所反映的发情周期阶段与直接卵巢的评估结果相一致。Haffman等(1976)研究表明,乳中P4浓度与血中P4浓度平行。祁生旺等(1994)测定结果表明,10头怀孕奶牛乳汁孕酮含量(平均5.62ng/mL)与10头发情期奶牛乳汁孕酮含量(平均为0.604ng/mL)二者差异显著,因此根据乳中或血浆中P4浓度的测定结果,可以进行早期妊娠诊断。血浆中P4的测定结果通常在授精后17～24d采血1mL/(头·次),离心后加入防腐剂冷冻保存24h后进行测定,奶牛血浆中P4≥1ng/mL判为妊娠。乳样中P4测定通常在授精后21～46d采取下午乳汁作检样,加入防腐剂后于4℃保存备用。测定时可用全乳或脱脂乳。由于乳汁中P4含量比血液中高,采样又比较方便,所以实际工作中常采用测定乳汁中P4含量,以判定是否妊娠。RIA法诊断奶牛早期妊娠研究报道较多。蒋寿等(1987)测定了193头奶牛输精后21、24、28及58d的奶桶混合乳P4含量,以6ng/mL作为诊断妊娠的标准,结果输精后21、24及28d采样监测3次,诊断为妊娠的准确率为90%(53/59),未孕的准确率为95%(57/60)。史远刚等(1996)将奶牛配种后22～24d,乳汁P4含量高于7.19ng/mL判为妊娠,低于4.72ng/mL判为未孕,介于两者之间判为可疑,据此标准妊娠准确率为92.3%,未孕的准确率为100%。郑明国等(1998)采用RIA法对124头奶牛配种后22～24d的奶样测定P4,60d左右做直肠检查比较符合情况,妊娠符合率为86%(43/50),未妊娠符合率为87.7%(57/64)。RIA法诊断奶牛早期妊娠精确度和灵敏度高,早孕诊断迅速,但因设备昂贵,技术要求高,操作费时且存在放射性危害等,从而限制了该技术的普及。段恩奎等(1987)先后采用将定量的乳汁加到普通滤纸上,自然干燥后测量P4浓度和用蘸有末乳的自然干燥滤纸编号后装入信封,寄往实验室测定P4浓度,以通讯或电话向生产单位报告结果获得成功,经对334头次奶牛现场早孕诊断,妊娠准确率78.03%(103/132),未孕准确率84.15%(170/202),配种后30d左右生产单位即可得到诊断结果,具有实用、简便和易于推广的特点。蔡志强等(2001)利用孕酮单克隆抗体,建立P4包被固相放免分析法(Sc-RIA),对20头配种奶牛进行早期妊娠诊断,妊娠诊断准确率达89.47%,未孕诊断准确率达100%。Sc-RIA法测量快速、简便,重复性稳定性好,测量结果准确,放射性废物容易处理,成本低,具有广阔的应用前景。国际原子能机构(IAFA)正在向发展中国家推广Sc-RIA法早期妊娠诊断技术。6自身酶联反应aa在乳牛诊断中的应用酶免疫测定法(EIA)是由Dray等(1975)建立的一种妊娠诊断方法。研究和应用最多的是乳汁P4的测定。用酶标记孕酮,根据肉眼观察酶作用于底物产生颜色反应的深浅进行定性试验,也可通过分光光度计或酶标读数器读取底物液的光密度值,然后计算P4浓度进行定量诊断。曾宪垠等(1996)应用双抗EIA测定了14头奶牛发情周期中奶牛孕酮浓度变化,配种后1～5d奶中孕酮含量较低,配种后6～10d,奶中孕酮含量逐渐上升,配种后11d,奶孕酮含量迅速上升,并维持到19d,配种后20d,未孕奶牛孕酮开始下降,并在21d陡降到最低水平,配种后21～24d,孕牛奶孕酮含量极显著高于非孕牛,表明双抗EIA可用于奶牛早孕诊断。EIA有多种方法,且在不断改进中,主要以酶联免疫吸附测定法(ELISA)常见。石放雄等(1987)用建立的固相微滴板酶免疫分析法测定101头奶牛,以配种后第20～22d、乳汁孕酮含量皆大于3ng/mL者为妊娠,连续2次小于3ng/mL者为空怀,间或有1次小于3ng/mL者为可疑,诊断为妊娠和空怀的准确率分别为92%和97%,可疑率为4%。龚振明等(1996)建立了用于乳牛早期妊娠诊断的二级竞争酶联反应孕酮临界点判别分析法,选择0.5ng/mL和1.0ng/mL作为妊娠诊断的临界点,对520头次配种后21d的乳牛进行测试,阴性正确率为90%(206/229),阳性正确率为79%(230/291)。郭大智(1996)建立了现场乳汁孕酮诊断乳牛早孕的简易方法,根据样品管与标准管颜色差异判断怀孕与未孕,检查110头(次)乳牛,未孕牛诊断准确率为95%(38/40),孕牛为83%(58/70)。杨国林等(1998)建立了目视ELISA测定孕酮的方法,对人工授精后19～23d的奶牛,挤末乳3mL测定,共检测乳样126份,已孕的判定准确率为79.22%(61/77),未孕的判定准确率为95.45%(42/44)。操作简便,适合生产单位临床应用。郭大智(2001)用建立并经改进的检测乳汁孕酮诊断奶牛早孕和发情的酶免疫分析法,测定112份奶样,经直肠检查和产犊情况核对,未孕的诊断准确率为100%(48/48),已孕的准确率为95.3%(61/64)。有准、早、易、安全等优点。为了使EIA法在生产中得到广泛应用,减少诊断时配制试剂的麻烦,缩短诊断时间,上世纪80年代国外开始研制孕酮酶标试剂盒取得成功。国内杨利国等(1988)、石放雄等(1990)、上海农学院等单位也分别研制出了孕酮酶免疫测试盒并进行奶牛早孕妊娠诊断,取得良好效果。郭大智(2002)研制出了现场快速诊断奶牛早孕与发情的酶免疫分析测试试剂盒,对孕牛和未孕牛诊断的准确率都在95%以上。7采用金相金显色法测孕酮含量北京万华生物工程有限公司在对孕酮免疫原合成和单克隆抗体制备研究过程中,获得了针对孕酮小分子半抗原决定簇的单克隆抗体,实现了对奶牛乳汁中孕酮激素含量的高灵敏度检测。在此基础上,采用胶体金双抗夹心法,将两个特异性单克隆抗体结合到孕酮分子上的两个不同位点,再借助胶体金显色效果,依据颜色的深浅来判断全乳中孕酮的含量。万积成等(2007)应用层析式双抗体夹心法原理研制的奶牛早孕诊断试纸,在北京10家奶牛场进行检测试验,对1559头奶牛配种后22～26d乳汁中孕酮含量进行临床符合验证,结果孕牛阳性临床符合率为96.8%(1274/1316),复测后阳性总符合率达98.5%(1296/1316);阴性临床符合率为97.1%(236/243),复测后阴性总符合率为97.9%(238/243)。该试纸条灵敏度高,最低检出量达5～8ng/mL,操作简便,5min即可判定结果;试纸常温保存,运输方便,价格低廉,能够快速、准确地进行奶牛早期妊娠诊断。8妊娠和空怀牛检查乳胶凝集抑制试验(LAIT)是一种免疫测定法。动物精卵结合成合子后,发育成为胚胎和胎盘,胚泡的绒毛膜滋养层细胞和胎盘子叶都能分泌类绒毛膜促性腺激素(类hCG)随乳汁或尿排出。利用LAIT检测尿液或乳汁中hCG存在与否,作为早孕诊断的一种依据进行早期妊娠诊断。方法是:在清洁玻片上滴加1滴待检尿液,接着加1滴妊娠诊断抗血清,用牙签拌匀或振荡2分钟,然后置显微镜下(100×)检查,出现均匀一致的凝集为阴性,保持乳胶状的则为阳性。凌志忠等(1992)先后对两批黑白花奶牛尿液检测表明,妊娠准确率分别为87%(46/53)和84%(48/57),空怀牛检测准确率分别为89.5%(43/48)和87.5%(42/48)。刘深廷等(1994)对184头配种后21～26d的奶牛分别用RIA、ELISA和LAIT法进行了早孕诊断对比试验,诊断总准确率分别为84.31%(43/51)、85.45%(47/55)和92.31%(72/78)。LAIT法比RIA法早孕诊断的灵敏性高,操作简单,容易掌握,工作效率高,且可现场进行,是基层单位值得大力推广的奶牛早孕诊断方法。但栾晓峰等(1998)用hCG试纸对奶牛检测妊娠组(怀孕4～8个月)和早孕组母牛都呈阴性,表明hCG试纸不能检出妊娠初、中、末期奶牛尿中的hCG样物质,因而对牛怀孕期间是否产生类hCG物质持怀疑态度。9对血清中碱性磷酸酶活力的影响碱性磷酸酶(AKP)是一组酶类,广泛分布于动物及人体组织中,尤其在小肠粘膜、胎盘、肾、骨、肝等组织器官中含量丰富。许多资料报道,受精卵分裂到桑椹胚的过程中,大而分裂慢的细胞中就含有碱性磷酸酶,胎盘亦可产生具有特异性的酶,为耐热性碱性磷酸酶,并随妊娠进展而增多。在孕妇及妊娠家畜,血液中碱性磷酸酶活力都比较高。近年来医学上已采用测定血清中碱性磷酸酶活力,作为骨病和妊娠检测的指标。伍先淑等(1993)对对照组34头奶牛于发情配种前采血1次,采用甘油磷酸法,以721型光电分光光度计测定血清中AKP,试验组36头奶牛配种后连续3个月每月定时采血测定AKP,结果试验组与对照组血清中AKP活力相比,从妊娠第1个月开始,血清中AKP活力平均值增高,但差异不显著,到妊娠第2个月,血清中AKP活力显著增高,且逐月递增。妊娠2、3个月的奶牛与对照组的血清AKP活力平均值之间差异极显著。因此,检测奶牛血清AKP活力的变化,有可能作为早期妊娠诊断的一种方法。这种方法操作简便,设备也不复杂,数小时之内可得出结果,在基层场站均能推广应用。10输精后未孕及妊娠合并心脏病cvmec的观察与诊断Aizinbudas和Dovutis