血小板功能检测

血小板功能检测：血小板在止血和动脉血栓形成中的作用包含粘附到受损血管处或破碎的动脉粥样硬化斑块处，形成止血栓或凝块；加快凝血瀑布致使凝血酶的形成。本文综述了血小板的作用，列举了遗传性的血小板缺点及异样出血性疾病，并议论了各样血小板致聚剂。本文综述了各样血小板功能检测方法以及它们的优弊端：出血时间测定；利用透光性的改变来检测枸橼酸钠抗凝的富含血小板血浆中血小板的齐集功能；阻抗齐集仪检测枸橼酸钠抗凝全血中血小板的齐集功能；高切变力血小板功能剖析仪（PFA-100）和Ultegra快速血小板功能测定仪检测血小板有关的止血功能；用锥板剖析仪检测高切变力下血小板的粘附和齐集功能；检测血小板颗粒内容物的分泌（ATP,14C-5-羟色胺,血小板第4因子和β－血小板球蛋白）和血栓烷B2的形成；流式细胞术检测体内和体外使用致聚剂的血小板激活状况（包含血小板膜糖蛋白构象改变，P-选择素和磷脂酰丝氨酸的表达）；检测遗传性缺点中血小板膜糖蛋白的水平。简介血小板在止血和血栓中的作用当血管损害时，血小板会快速粘附到损害处，齐集形成由纤维蛋白固定的止血块。在微血管损害处及破碎的动脉粥样硬化斑块处也会发生近似的过程，最后形成血小板－纤维蛋白血栓，引起动脉硬化症的血栓性并发症。体内能够激活血小板的引诱剂主要有胶原蛋白，ADP，血栓烷A2（TXA2），凝血酶，弱引诱剂有5－羟色胺和肾上腺素。血小板上不单有针对这些介质的受体，还有纤维蛋白原和VWF的受体。TXA2的形成和开释以及血小板致密颗粒中分泌的ADP和5－羟色胺会加快血小板的激活过程，促凝表面的裸露促进凝血酶的形成，而凝血酶是强有效的激活剂。激活也会引诱α-颗粒内容物的分泌和颗粒跨膜蛋白P-选择素出此刻血小板的表面上。全部血小板致聚剂都拥有共同作用，所以当凝聚过程的某个门路存在缺点或被克制时，血小板的凝聚功能将被大大受损。在血管壁的损害处，血小板与内皮下细胞外基质中的VonWillebrand因子（VWF），胶原蛋白和纤维联合素粘附在一同。在高切变力状况下，血小板糖蛋白GPIb/IX/V复合物与VWF的互相反响是特别短暂的，但当VWF与血小板表面的GPIIb/IIIa联合，这一过程会变为不行逆的。血小板表面胶原蛋白受体包含GPIa/IIa（α2β1），它在粘附过程中拥有特别重要的作用；而GPVI在血小板活化惹起TXA2的形成和开释以及致密颗粒和α储存颗粒内容物的分泌过程中起作用。血小板存在TXA2和ADP受体，在损害处流动的血小板受刺激后会改变形状，伸出伪足，从而在粘附血小板四周形成齐集物。齐集过程需要血小板表面的异二聚体整合素分泌和血小板表面磷脂双分子层翻转裸露促凝磷脂表面，往常为磷脂酰丝氨酸（PS）翻转到血小板表面。也会产生促凝活性的微粒。PS的裸露大大加快了凝血门路因子Ⅹ和凝血酶原酶的反响，产生了最有效的血小板引诱剂--凝血酶。凝血酶切开血小板表面的蛋白酶激活受体，致使GPIIbGPIIb/IIIa复合物转变为纤维蛋白原的受体或某些状况下作为VWF的受体。这些蛋白会在周边的受刺激的血小板之间搭桥。激活的正常的GPIIb/IIIa在血小板齐集过程中特别重要。当血小板受胶原蛋白和凝血酶等致聚剂刺激，能惹起血小板颗粒的/IIIa的激活，形成TXA2和惹起血小板颗粒内容物的分泌。凝血酶相同促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白，包裹在血小板聚合物表面形成牢固的止血块或血栓。在磷脂酶A2作用下膜磷脂释要目的在于确立异样出血的原由或保证在手术或牙科侵入性操作（包含拔牙）过程中的正常止血功能。多种方法试试来证明高血小板活性有血栓形成的偏向，这个专题近来被Thiagarajan和Wu等进行综述。异样出血常有的原由为血小板减少症，这可经过血小板计数来确立。当血小板计数低放出花生四烯酸时可产生TXA2。在环氧化酶（COX-1）和血栓烷合酶作用下，花生四烯酸转变为TXA2。TXA2只好短期存在，很快形成无活性的稳固产物TXB2。COX－1被阿司匹林不行逆地灭活，所以血小板生成TXA2的能力遇到它们在外周循环逗留时间的影响。任何一项血小板功能受损，都会削弱凝血功能。血小板功能检测的主于50-70×109/l，就会致使瘀斑和凝血异样。血小板减少症会影响大部分血小板功能检测方法，但对流式细胞术除外。遗传性和获取性血小板功能缺点表1列举了部分遗传性疾病，它们的血小板功能存在某种程度的受损，有显然的出血症状。除VonWillebrand病(VWD)外，大部分缺点特别稀有。固然某些食品和天然物质中含有克制物，可是药物要素还是最主要的惹起获取性血小板功能低下的原由。克制血小板功能的药物中有能抑制COX的阿斯匹林和其余非甾醇类抗感染药，抗生素如青霉素，thienopyridines（噻氯匹定和clopidogrel），GPIIb/IIIa拮抗剂，影响cAMP水平的药物，抗凝剂如肝素，纤溶制剂，心血管药物，神经科药物和麻醉药物等。到当前为止阿司匹林是最常有的克制剂，至罕有250种药物中含有这类成分。阿司匹林的作用是长久的，它对COX-1的乙酰化作用是不行逆的。非血液系统疾病惹起血小板功能降低的疾病有：尿毒症，慢性肝病，骨髓增殖性疾病和获取性VWD。表1遗传性出血疾病Glanzmann血小板机能不全：GPIIb/IIIa（αIIbβ3）缺失或异样它是纤维蛋白原和VWF的受体，对任何血小板致聚剂无反响。Bernard-Soulier巨大血小板综合症：GPIb/IX/V缺失或异样它参加血小板与内皮下的VWF粘附。对瑞斯霉素无反响。GPIa/IIa（α2β1）缺失或异样。不可以粘附胶原蛋白GPVI缺失或异样。不可以被胶原蛋白激活P2Y12缺失或异样。它是ADP和腺苷酰环化酶的受体。特别稀有储存池疾病包含血小板分泌缺点初级分泌缺点。是因为颗粒内容物缺点或放大门路缺点以外的原由惹起的一大类分泌性疾病—最常有的先本性分泌缺点病致密颗粒缺点（δ－颗粒）（如Hermansky-Pudlack综合症，Chediak-Higashi综合症）α－颗粒缺点（α－颗粒）（灰血小板综合症）致密颗粒和α－颗粒缺点Quebec血小板综合症Jacobsen或Paris-Trousseau综合症Scott综合症。刺激后不形成促凝表面花生四烯酸动员，环氧化酶，血栓烷酶或TXA2受体、VWF缺点1型VWD-VWF部分减少（占80％病例）2型VWD－VWF异样（占15-20％病例）3型VWD－VWF缺失（稀有）血小板型VWD。GPIb/IX/V表型功能加强纤维蛋白原缺乏症血小板功能检测最早的检测血小板功能的方法是出血时间。Thiagarajan和Wu定义的皮肤表面出血时间为：在上臂处用血压绷带加压到40mmHg，而后采用一次性的自动的设施在前臂的掌侧皮肤表面上划一道长10mm，深1mm标准的切口，每隔30秒吸去伤口处的血液，直到出血停止。正常的出血时间少于10分钟。当血小板计数小于100×109/l时，出血时间会延伸，所以这一方法“在血小板减少的患者测定血小板功能的缺点时作用有限”。它的长处在于操作简单，快速，不需要对血液进一步的检测和办理，弊端是受技术人员的操作技术，皮肤厚度和温度的影响。本方法缺乏一致性，在判断出血偏向方面是不敏感指标。其余血小板功能检测方法需要当心抽血和办理。患者不可以加绷带和一周不可以服用影响血小板功能的药物。19-20号针头和塑料注射器用于静脉穿刺，从静脉穿刺到实验的间隔时间必要标准化，这是因为血样中丢掉的CO2会使pH值高升，增添血小板对致聚剂的反响能力。必须防备溶血，因为溶解的红细胞会开释出血小板的引诱剂ADP。容器一定是塑料的或硅化玻璃以防备血小板吸附到容器表面。抗凝剂的选择以及温度也会影响血小板的功能，抗凝血应置于室温或37℃，而不可以置于4℃。一般不介绍使用真空管，除非使用自动血小板功能剖析仪（见和）。最常有的抗凝剂是枸橼酸钠，它能够将钙离子的浓度降到微摩尔级（枸橼酸钠终浓度为，钙离子的浓度为40μM；枸橼酸钠终浓度为，钙离子的浓度＜5μM）。假如使用EDTA抗凝剂，钙离子的浓度将能低至不可以使血小板凝聚。肝素的成效不好，因为血小板常常粘附到试管壁，并且会使血小板集聚，在离心中堆积到红细胞中，使富含血小板血浆中的血小板数量减少。水蛭素和PPACK经过克制凝血酶的活性来抗凝，它们能够保持生理性浓度的钙离子，而某些实验中正需要这类浓度，但水蛭素的价钱特别昂贵没法惯例使用。血小板齐集到当前为止评论血小板功能最常有的方法是测定血小板的齐集功能，抗凝血在离心力135g离心15分钟，制备富含血小板血浆（PRP）。假如可能，血小板计数应该标准化（如在浓度为250×109/l时测定）,这能够经过加入少血小板血浆来实现。1毫升（或毫升）PRP在37℃加入到装有金属磁棒的玻璃试管中，在齐集仪中磁棒以1100rpm转动，经过比色计记录穿过PRP的光强度。大部分引诱剂加入后，血小板形态由片状转变为圆形，形成伪足，惹起短暂的光透过率的降落，而后因为血小板齐集，光透过率大幅度增添。光透过率增添的速度和程度会被记录下来。致聚剂主要为ADP，肾上腺素，胶原蛋白，花生四烯酸，TTXA2的近似物如U46619，或凝血酶受体活化肽如SFLLRN。（凝血酶不可以作为PRP的促凝剂，因为会惹起凝固）。正常状况下枸橼酸抗凝的PRP，对高浓度致聚剂反响的齐集程度，与TXA2的形成，颗粒内容物的分泌和血小板表面P-选择素的形成有关。低血小板计数会影响血小板齐集试验，假如PRP中血小板计数低于100×109/l结果就不行靠。假如是脂血，也不可以进行此试验。假如血小板改变了形态，但不可以与全部的致聚剂发生齐集，则其原由可能是稀有的Glanzmann血小板减少症。与胶原蛋白或凝血酶对比，ADP是弱的致聚剂，在枸橼酸抗凝的PRP中，低浓度ADP只引开初步的，不完整的，可逆的齐集。但当浓度高于1-3μM时，初级的血小板齐集将不行逆，并且紧接着会惹起第二相不行逆的过程（图1）。这个两相血小板齐集过程依靠TXA2的形成。高浓度ADP状况下，这两相齐集过程会交融，形成一个光滑的曲线（图1），近似于胶原蛋白或凝血酶的刺激成效。药物，如阿司匹林，会克制TXA2的形成，阻挡了ADP介导的第二相齐集过程。在生理性的钙离子介质中，只会发生第一相的齐集反响。ADP引诱齐集严重减弱，以及胶原蛋白和凝血酶引诱齐集受损，提示为稀有的P2Y12ADP受体异样。噻氯匹定和clopidogrel经过此受体作用，产生近似的对ADP引诱选择性克制。弱的致聚剂，肾上腺素（5-10uM），可齐集PRP中的血小板，而不改变血小板的形态，但肾上腺素的致聚作用其实不一致。假如服用了阿司匹林或其余克制TXA2形成的药物，血小板对任何浓度的肾上腺素都不反响，不会产生齐集。胶原纤维（1-5μg/ml）会惹起特点性滞后（可达1分钟）的血小板齐集,齐集需要TXA2形成和颗粒内容物的分泌，并且基本上是不行逆的。固然血小板形态发生了变化，可是阿司匹林及其余克制TXA2形成的药物能够阻断低浓度的胶原蛋白惹起的齐集反响。稀有的GPVI缺点症表现为血小板受胶原蛋白刺激后其实不发生齐集，但在遇到其余致聚剂的刺激后往常会发生齐集。花生四烯酸能够转变为TXA2，所以可作为齐集剂。阿司匹林和其余能够克制环氧化酶的药物拥有克制作用。可是TXA2的近似物U46619，却能够在此类克制剂的存在状况下产生齐集作用。在稀有的环氧化酶缺失的病人，花生四烯酸不引诱血小板齐集，但U46619会惹起血小板的齐集。SFLLRN(TRAP)拥有凝血酶的引诱血小板强齐集作用的功能，只有当TXA2形成阻碍时，这一作用才会稍有减弱。分泌缺点，特别是致密颗粒缺乏ADP的加强作用，会造成异样的齐集，即存在正常的第一相过程，而无第二相过程。分泌缺点时低浓度的胶原蛋白和SFLLRN引诱血小板齐集合减弱。瑞托霉素齐集血小板这一试验相同用齐集仪对枸橼酸抗凝的PRP进行测试。抗生素瑞托霉素可作为致聚剂，终浓度常有为ml。正常的样本是第一相齐集后紧接着会发生第二相齐集。缺乏反响提示为Bernard-Soulier综合症或VWF缺乏。全血血小板齐集用阻抗血小板齐集仪可测定稀释的抗凝全血的血小板齐集功能。将两个电极插入样本中，当有电流经过时，血小板会粘附到电极上。而后增添致聚剂加以搅拌，在电极上的血小板四周血小板齐集，记录阻抗变化的速率和幅度。这一试验的长处在于不用制备PRP，并且脂血中的血小板功能也可丈量，但不适合血小板计数极低的病人。血小板功能剖析仪－100DadeBehring血小板功能剖析仪（PFA－100）是微办理器控制的仪器，它可定量测定高切变力下血小板和血小板有关的止血功能。试验过程为枸橼酸抗凝血加到装有一次性试验管的槽内（要求4小时内血样），预温到37℃，而后利用真空吸力使血样经过一个直径200μm的不锈钢毛细管和直径为150μm的硝酸纤维膜微孔，膜上包被胶原蛋白和肾上腺素（CEPI）或胶原蛋白和ADP（CADP）。在5000-6000/s的高切变和引诱剂的作用下，血小板产生齐集，阻挡血液穿过微孔，拥塞微孔的时间称为停止时间（CT），最大测定值为300秒。血小板最先经过GPIb/IX/V和VWF间的互相作用以及GPIa/IIa,VWF的直接连结粘附到膜上的胶原蛋白上致使齐集，而不是由纤维蛋白原连结到活化血小板的GPIIb/IIIa惹起齐集。的枸橼酸钠抗凝时获取的CT值比浓度为枸橼酸钠抗凝CT值要大，所以选择适合的抗凝剂浓度是特别重要的。PPACK也可用作抗凝剂。仅在CEPI管CT时间延伸，可能是稍微的遗传性血小板功能缺点（如储存池异样）和阿司匹林克制。CEPI管和CADP管CT时间均延伸，可能为严重的遗传性血小板功能阻碍（如Glanzmann血小板机能不全和Bernard-Soulier综合症）和VWD。实质上PFA-100是有效的挑选VWD的手段，特别是1型－VWD，并且对妇女月经过多及少儿的鼻出血思疑有血小板异样或VWD进行鉴识是特别实用的。它同时有益于监测1型－VWD患者对DDAVP的反响和PTCA患者对GPIIb/IIIa拮抗剂的反响，也可用于评估血库供给的浓缩血小板质量和血小板输注的效果。PFA-100拥有操作简单，快速，重复性好，全血用量少的长处。血小板计数少于50×109/L和红细胞比容＜25％时会惹起CT时间延伸。Ultegra快速血小板功能检测Accumetrics快速血小板功能实验（RPFA）供给了一种简单，快速，正确的血小板功能检测方法，它用于床边监测接受GPIIb/IIIa拮抗剂的患者。枸橼酸钠抗凝全血收集后，立刻取样本加到有2个样本通道的一次性试管中。经过由微办理器驱动的钢珠运动，血液与血小板致聚剂（iso-S）FLLRN和纤维蛋白原包被的聚苯乙烯珠混匀70秒，检测样本的透光强度。激活的血小板和包被纤维蛋白原的珠子之间发生凝聚，沉入底部，惹起光透过率的增添。凝聚的速度和强度可用血小板凝聚单位（PAU）计算，当有GPIIb/IIIa拮抗剂存在，PAU值会快速降落，这是因为凝聚发生与活化血小板上的未被阻断的GPIIb/IIIa受体成正比关系。RPFA用来监测GPIIb/IIIa拮抗剂abciximab,tirofiban,eptifibatide和orofiban对血小板的阻断成效。锥板剖析仪Varon及其同事开发了锥板剖析仪（CPA），在高切变力的条件下使用锥板粘度计检测血小板的粘附和齐集。这一装置经过锥体的旋转在板表面产生均一的切变压力惹起层流。的枸橼酸钠抗凝全血加到聚苯乙烯板上，以1800/s切变速度旋转2分钟，随后染色。图形剖析仪分析粘附的血小板和血小板齐集，可供给大小散布的的直方图，表面覆盖的百分比(SC)和均匀大小(AS)。血小板粘附到聚苯乙烯板上依靠于板上包被的VWF和纤维蛋白原，GPIIb/IIIa，GPIb/IX/V以及血小板的激活。CPA可快速确立先本性和获取性的血小板缺点及VWD，也可测试抗血小板疗效和确立血小板功能亢进患者的血栓前形成状态。CPA的长处在于快速，简单，只要全血。颗粒内容物分泌的检测发光齐集仪可同时检测血小板齐集和ATP（一种致密颗粒的构成部分）的开释。用荧光素酶检测ATP，ATP的浓度参照正常人PRP和已知ATP浓度制备的标准曲线进行计算。加入引诱剂，检测已标志血小板的14C-5-羟色胺的分泌状况可指示致密颗粒的分泌状况。当引诱分泌内容物时，α颗粒跨膜蛋白P-选择素会出此刻血小板的表面，这可经过流式细胞仪检测（见）。血小板第4因子（PF4）和β－血小板球蛋白是血小板特异性蛋白，储存于α颗粒，在血小板激活时开释。可用放射性免疫方法测定，但应注意静脉穿刺对结果影响比较大。花生四烯酸的动员和血栓烷B2的形成在正常状况下，引诱剂可将花生四烯酸从血小板的磷脂层中动员出来，并经过血小板转变为血栓烷B2。血栓烷B2是一种稳固的复合物，可经过商用的放射性免疫测定法和酶免法来测定。流式细胞术流式细胞术可快速检测抗凝血、稀释全血、PRP、人工介质中悬浮的少许血小板。使用全血能够防止操作过程中血小板被激活。往常血小板与联接不一样光谱的荧光素的两种单克隆抗体（MoAbs）反响。为确立血小板的特异性，第一个MoAb特异性针对GPIb,IIb或IIIa，并在近饱和溶液中使用。为确立血小板上的抗原决定簇，血小板还与另一标志MoAb反响。这类MoAb特异性针对表位，也在饱和溶液中使用。与抗体孵育后，稀释样本以1000-100，000细胞/min的速度在流式细胞仪上检测。聚焦激光束在其相应的汲取光谱内激发了联接的荧光。血小板经过表记的荧光素以及前向角和侧向角的特征进行确认。第二个单抗发出的荧光强弱与某一抗原决定簇的密度成正比，并可经过获取上千个血小板来计数。这些数据均可用软件来剖析。因为激发光谱有部分被重叠，每一混淆荧光需设置赔偿。假如抗原决定簇的表达跟着时间而变化（如膜GPs的滑动），着色前血小板可先用1％的多聚甲醛固定，它不扰乱抗体联合。假如不是立刻进行流式细胞仪检测，血小板也可在加入着色剂后再固定（原理同上）。很多荧光素标志的抗体及非抗体源的探针均可标志血小板抗原决定簇。MoAbs除能够和未被活化血小板的GPs联合外，某些激活依靠MoAbs可检测GPs构象变化（如PAC1可检测GPIIb/IIIa）或颗粒膜蛋白表达（如抗P－选择素）。非抗体探针包含PKH亲脂性膜染料，可用链亲和素标志荧光检测的生物素和用于检测血小板活化促凝表面的裸露状况的荧光标志的an