天然药化显色反应与提取分离

天然药物化学定义：天然药物化学是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门学科。天然药物化学研究内容：其研究内容包括各类天然药物的化学成分的结构特点、物理化学性质、提取分离方法以及主要类型化学成分的结构鉴定等。此外，还将涉及主要类型化学成分的生物合成途径等途径。主要生物合成途径（一） 醋酸-丙二酸途径（AA-MA）主要产物：脂肪酸类、酚类、蒽酮类起始物质：乙酰辅酶A起碳链延伸作用的是：丙二酸单酰辅酶A碳链的延伸由缩合及还原两个步骤交替而成，得到的饱和脂肪酸均为偶数。碳链为奇数的脂肪酸起始物质不是乙酰辅酶A,而是丙酰辅酶A。酚类与脂肪酸不同之处是在由乙酰辅酶A出发延伸碳链过程中只有缩合过程。（二） 甲戊二羟酸途径（MVA）主要产物：萜类、甾体类化合物起始物质：乙酰辅酶A焦磷酸烯丙酯（IPP）起碳链延伸作用焦磷酸二甲烯丙酯（DMAPP）单萜 得到焦磷酸香叶酯（10个碳）倍半萜类 得到焦磷酸金合欢酯（15个碳）三萜 得到焦磷酸香叶基香叶酯（20个碳）（三） 桂皮酸途径主要产物：苯丙素类、香豆素类、木质素类、木脂体类、黄酮类（四） 氨基酸途径主要产物：生物碱类并非所有的氨基酸都能转变为生物碱,在脂肪族氨基酸中主要有鸟氨酸、赖氨酸,芳香族中则有苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸三、提取分离方法（一）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离常见方法有液-液萃取法、逆流分溶法（CCD）、液滴逆流色谱法（DCCC）、高速逆流色谱（HSCCC）、气液分配色谱（GC或GLC）及液-液分配色谱（LC或LLC）（二） 根据物质的吸附性差别进行分离1吸附过程三要素：吸附剂、溶质、溶剂硅胶、氧化铝：极性吸附剂活性炭：非极性吸附剂.聚酰胺吸附色谱法 聚酰胺吸附属于氢键吸附适用范围：极性物质与非极性物质均可适用,特别适合于酚类、醌类、黄酮类,对其吸附是可逆的（鞣质例外）,分离效果好,此外,对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等化合物也有广泛用途。因为对鞣质吸附特强,近乎不可逆,故用于植物粗提取物的脱鞣处理特别适宜原理：一般认为是通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基,或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。规律：在含水溶剂中（1）形成氢键的基团数目越多,则吸附能力越强（2）易形成分子内氢键者其在聚酰胺上的吸附即相应减弱（3）分子中芳香化程度高者,则吸附性增强,反之,则减弱。各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力顺序：水＜甲醇＜丙酮＜氢氧化钠水溶液＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺＜尿素水溶液（三） 根据物质分子大小差别进行分离凝胶种类：（1）葡聚糖凝胶（SephadexG）（2）羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）（四）根据物质离解程度不同进行分离四中草药有效成分的提取方法：（1） 溶剂提取法：①原理一一“相似者相容”原理②常见溶剂的极性强弱顺序：石油醚（低沸点一高沸点）＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜乙腈＜水＜吡啶＜乙酸（2） 水蒸气蒸馏法：适用于具有挥发性的,能随水蒸气蒸馏而不被破坏且难溶或不溶于水的成分的提取（3）升华法：中药中有一些成分具有升华的性质,能利用升华的方法直接从中药中提取出来。一苷的分类根据苷在生物体内是原生的还是次生的可将苷分为原生苷和次生苷根据苷中含有的单糖基的个数可将苷分为单糖苷、双糖苷、叁糖苷。根据苷元上与糖连接位置的数目可将苷分为单糖链苷、双糖链苷。根据苷元化学结构的类型可将苷分为黄酮苷、蒽醌苷、苯丙素苷、生物碱苷、三萜苷等。根据苷键原子可将苷分为氧苷、氮苷、硫苷、碳苷。二、 糖的化学性质氧化反应过碘酸氧化作用机理：过碘酸与邻二醇羟基形成五元环状酯的中间体,然后再将醇羟基氧化成羰基。酸性或中性条件下,对顺式邻二醇羟基的氧化比反式的快碱性条件下,对顺式和反式的反应速度相同Molish反应的试剂：浓硫酸和a-萘酚三、 苷键的裂解分类：酸催化水解、碱催化水解、乙酰解、酶解、过碘酸裂（一） 酸催化水解试剂：水或稀醇催化剂：稀盐酸、稀硫酸、乙酸、甲酸等反应机理：苷键原子先被质子化,然后苷键断裂形成糖基正离子或半椅式的中间体,该中间体再与水结合形成糖,并释放催化剂质子。规律：1）按苷键原子不同,酸水解的易难顺序为：N-苷＞0-苷〉S-苷〉一苷（原子的电负性）。（2）糖上取代基的影响：苷键邻近取代基对苷键原子电子云密度影响较大,如2-氨基糖较2-羟基糖难水解；2-羟基糖

又较2-去氧糖难水解。（3）吡喃糖苷中吡喃环的C-5上取代基越大越难水解，因此五碳糖最易水解，其顺序为：五碳糖〉甲基五碳糖〉六碳糖＞七碳糖。如果接有-COOH,则最难水解。4）呋喃糖苷较吡喃糖苷易于水解。（5）酮糖较醛糖易水解。（6）芳香族苷（如黄酮苷、蒽醌苷）水解比脂肪族苷（如萜苷、甾苷）容易得多。（二）乙酰解反应0-苷键葡萄糖双糖乙酰解的难易程度：（1-2）＞（1-3）＞（1-4）＞＞（1-6）（三）碱催化水解酰苷、酚苷、与羰基共轭的稀醇苷可被碱水解（四）过碘酸裂解反应适用情况：特别适用于那些苷元不稳定的苷和碳苷的裂解,对那些苷元上有邻二醇羟基或已被氧化的基团的苷则不能适用,因为过碘酸在氧化糖的同时他们也将随之被氧化。所用试剂：NaIO4和NaBH4一．香豆素的理化性质（1）性状：游离香豆素多有完好的结晶,常常是淡黄色或是无色,并且具有香味,小分子的游离香豆素有挥发性,能升华。成甘后无此些性质。香豆素衍生物在紫外光照射下呈现蓝色或紫色荧光,在碱性溶液中荧光增强。（2）内酯的性质：遇到稀碱溶液可以开环,形成溶于水的顺式邻羟基桂皮酸盐,酸化后又立即开环,形成不溶于水的香豆素类成分。香豆素的显色反应（1）异羟肟酸铁反应：在碱性条件下,香豆素类化合物的内酯环打开,与盐酸羟胺缩合生成异羟肟酸,在酸性条件下在于Fe3+络合呈现红色。（2）具有酚羟基取代的香豆素类化合物可以与诸如三氯化铁等多种酚类试剂呈现颜色反应,如果酚羟基的对位无取代或者6位碳上无取代的香豆素衍生物,可以与Gibbs试剂及Emerson试剂呈现颜色反应。Gibbs-2,6-二氯（溴）苯醌氯亚胺-蓝色Emerson—氨基安替亚林和铁氯化钾一红色香豆素类化合物的提取分离（1）.提取：溶剂提取法,水蒸气蒸馏法碱溶酸沉法药材｛不同浓度EtOH醇提液T回收溶剂加水水溶液T有机溶剂萃取石油醚苯乙醚乙酸乙酯石油醚乙醚乙酸乙酯正丁醇极性由低到高萃取（2）.分离经典柱色谱（硅胶酸性或中性氧化铝作固定相）制备薄层色谱高相液相色谱。二、醌类化合物的理化性质物理性质：升华性溶解性1酸性：2-羟基苯醌或在萘醌的醌环上有羟基时表现出与羧基相似的酸性,可溶于NaHCO3水溶液，萘酿及蒽酿苯环上的0-位羟基的酸性次之,可溶于Na2CO3水溶液中，而a-位上的羟基因与C=O基形成氢键缔合,表现出更弱的酸性，只能溶于NaOH水溶液游离蒽醌类衍生物酸性强弱顺序：含一COOH＞含两个以上0-OH＞含一个0-OH＞含两个a-OH＞含一个a-OH。故可从有机溶剂中依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、1%NaOH、5%NaOH水溶液进行梯度萃取，达到分离的目的。颜色反应：（1）Feigl反应（菲格格）一一醌类氧化还原过程酿类衍生物在OH-下经加热能迅速与醛类及二硝基苯反应，生成紫色化合物。无色亚甲蓝显色试验苯酿、萘酿——区别于蒽酿无色亚甲蓝溶液用于PPC及TLC作为喷雾剂，能检出苯醌及萘醌，样品在白色背景上作为蓝色斑点出现。（3）碱性条件下的显色反应羟基酿类在碱性溶液中发生颜色改变，会使颜色加深。多呈橙、红、紫红色及蓝色。Borntrager's反应（保恩特来格）羟基蒽醌类化合物遇碱显红~紫红色的反应。（4）与活性次甲基试剂反应（Kesting-Craven法） 苯酿、萘酿——区别于蒽酿当苯酿及萘酿类化合物的醌环上有未被取代的位置时，即可在氨碱性下与一些含有活性次甲基试剂（如：丙二酸酯、乙酰醋酸酯等）的醇溶液反应，生成兰绿色或兰紫色。（5）与金属离子反应在蒽酿类化合物结构中，如果有a-酚羟基或具有邻二酚羟基时，则可与Pb++、Mg++等金属离子形成络合物。蒽醌类化合物的提取分离提取：有机溶剂提取法（苷元可用极性小的溶剂提取）碱提酸沉法（带游离酚羟基的醌）水蒸气蒸馏法（分子量小的）分离pH梯度分离色谱法（硅胶吸附色谱或者聚酰胺，不用氧化铝）四黄酮化合物5.1黄酮分类：根据中央三碳链的氧化程度、B-环连接位置（2-或3-位）以及三碳链是否构成环状等特点可将主要天然黄酮类化合物分类：黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、异黄酮类、鱼藤酮类、紫檀素类、二氢黄酮醇类、花色素类、查耳酮类、二氢查耳酮类等5.2黄酮化合物的提取及方法极性大的苷/昔元f用甲醇~水（1:1）或甲醇②极性小的苷/苷元—氯仿、乙酸乙酯、乙醚等低极性的溶剂提取1溶剂萃取法：利用黄酮类化合物与混合的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化的目2碱提取全沉淀法：黄酮类化合物可溶于水，但难溶于酸性水，易溶于碱性水。碱水浓度不宜过大，酸化时，酸性不宜太强3活性炭吸附法5.3黄酮类化合物的分离聚聚｝（1）柱色谱法：①硅胶柱色谱②胺柱色谱（苷元相同，洗脱的先后顺序聚聚｝三糖苷，双糖苷，单糖苷）③葡聚糖2用于分离黄酮类化合物的葡聚糖凝胶主要有SephadexG和SephadexLH-2（两种型号。三糖苷，双糖苷，单糖苷）③葡聚糖2用于分离黄酮类化合物的葡聚糖凝胶分离黄酮苷元时，主要靠吸附作用，凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目，与酚羟基的位置无关；分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用，黄酮苷按照分子量由大到小的顺序出柱。常用的洗脱剂有：a.碱性水溶液（如0.1mol/LNH4OH）,含盐水溶液（如0.5mol/LNaCl）。b.醇及含水醇，如甲醇、甲辱水、乙醇等°c.其他溶剂，如含水丙酮、氯仿等试剂反应，生成有色络合物。OHOOH（1,铝盐的络合反应常用1%三氯化铝或亚硝酸铝溶液，生成的络合物为黄色。（2,铅盐的络合反应常用1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，生成络合物为黄~红色。醋酸铅：只能与具有邻二酚羟基3-OH-4-酮和5-OH-4酮结构的化合物络合。碱式醋酸铅：一般的酚类化合物均可与之络合。或3,4,-二羟基取代时，在碱性条件下易被氧化，生成由黄色~深红色~棕绿色沉淀。五．萜类化合物的理化性质加成反应（含有双键或羰基的萜类化合物）1^Diels_Alder加成反应带有共轭双键的萜类化合物能呂与顺丁烯二酸酐产生Diels-Alder加成反应，生成结晶形加成产物，可借以证明共轭双键的存在2•与吉拉德试剂加成分离含有羰基的萜类化合物I常采用吉拉德试剂带有季胺基团的胺肼提出酸、碱成分的中性挥发油，加吉拉甲醇等。3甲醇等。3,锆盐的络合反应常用2%二氯氧化锆甲醇溶梯度PH萃取法：根据含有酚不同液。德试剂的乙醇溶液，再加入10%醋酸促进反应。加热回流，反应完毕后加水稀－OH不同依次用5%NaHCO、5%NaCO、－OH不同依次用5%NaHCO、5%NaCO、3230.2%NaOH、4%NaOH溶液萃取 褪色（只有5-羟基,2酸性强弱 7,4'-二羟基＞7或4'-羟基＞一般酚羟基＞5-羟基弱碱 溶于NaHCOgI溶于NaCO+溶于不同浓度的NaOH235.4黄酮显色反应由于黄酮类化合物结构中?毗喃酮和酚羟基的存在，可以用多种显色反应对不同类型和取代模式的黄酮类化合物进行鉴别：还原反应（1,盐酸-镁粉（锌粉,反应此反应为鉴别黄酮类化合物最常用的显色反应盐酸-镁粉反应：（阳性,——黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇（阴性,——查耳酮、橙酮、儿茶素类、大多数异黄酮盐酸-锌粉反应：（阳性,——二氢黄酮醇、黄酮醇3-0糖苷（阴性）一一黄酮醇，二氢黄酮醇3-0糖苷（2）四氢硼钠NaBH4）反应此反应是二氢黄酮类化合物专属性的反应。方法是将样品溶于乙醇中，加等量%NaBH4的甲醇溶液，一分钟后加浓盐酸或浓硫酸数滴，生成紫~紫红色。2.金属盐类试剂的络合反应黄酮类化合物的结构中常含有如下结构单元，因此可以和铝盐、铅盐、锆盐、镁盐样品甲醇溶液■2%ZrOC2溶―k黄绿色络合物+2%枸橼酸'（有3-或5-羟基）不褪色（有3■羟基）（4,镁盐的络合反应常用醋酸镁甲醇溶液为显色剂，可在滤纸上进行。二氢黄酮、二氢黄酮醇一一天蓝色黄酮、黄酮醇、异黄酮一一黄~橙黄~褐色（5）二氯化锶（SrCjp反应样品溶于甲醇中，加入几滴0.01mol/L二氯化锶甲醇溶液，再加几滴氨蒸气饱和的甲醇溶液，含有邻二酚羟基的化合物生成绿~棕~黑色沉淀。硼酸显色反应黄酮类化合物含有如下结构时，在无机酸或有机酸的条件下，可与硼酸络合，生成亮黄色的产物，故-羟基黄酮及2，-羟碱性溶剂下显色反应（1） 二氢黄酮在碱性条件下易开环转，变成相应的异构体一一查耳酮，显~橙黄色。（2） 黄酮醇类在碱性条件下先呈黄色通，入空气后变成棕色，可以和其他类加以区别。（3） 黄酮类化合物结构中含有邻二酚羟基释，分离水层，加酸酸化，再用乙醚萃取，蒸去乙醚后复得原拨基化合物萜类化合物的提取分离提取：（1）溶剂提取法：①环烯醚萜苷多用甲醇或乙醇为溶剂进行提取②非苷形式的萜类化合物一般用有机溶剂进行提取（2）碱提取酸沉淀法：利用内酯化合物在热碱溶液中开环成盐溶于水中，酸化后又闭环，析出原内酯化合物的特征来提取倍半萜类内酯化合物（3）吸附法：①活性碳吸附法②打孔树脂吸附法分离：（1）结晶法分离（2）柱色谱法分离（3）利用结构中特殊官能团进行分离挥发油的组成：（1）萜类化合物（2）芳香族化合物（3）脂肪族化合物（4）其他类化合物挥发油的提取（1）水蒸气蒸馏法：挥发油与水不相混合，当受热后，二者蒸汽压的总和与大气压相等时，溶液即开始沸腾，继续加热，则挥发油可随水蒸气蒸馏出来（2）浸取法：①油脂吸收法利用油脂的挥发性提取贵重的挥发油溶剂萃取法③超临界流体萃取法(3)冷压法：适用于新鲜原料挥发油的分离冷冻处理分流法化学方法色谱分离法六三萜类及挥发油三萜化合物具有表面活性和溶血作用四环三萜(tetracyclictriterpenoids)达玛烷型，羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿尔廷型、葫芦烷型、楝烷型。五环三萜齐墩果烷型(甘草，柴胡，商陆)、乌苏烷型(地榆)、羽扇豆烷型(白头翁)、木栓烷型(雷公藤)。三萜化合物的颜色反应：醋酐－浓硫酸反应：将样本溶入醋酐中，加浓硫酸一醋酐，将产生黄一红一紫一蓝等颜色变化，最后褪色五氯化锑反应：将样品氯仿或醇溶液点在滤纸上，喷以20％五氯化锑的氯仿溶液，干燥后60〜70°C加热，显蓝色，灰蓝色，灰紫色等三氯醋酸反应：将样品溶液滴在滤纸上，喷25％三氯醋酸乙醇溶液，加热至100C，红一紫渐变4氯仿-浓硫酸反应：样品溶于氯仿，加入浓硫酸后，在氯仿层出现红色或蓝色，氯仿层有绿色荧光出现5冰醋酸-乙酰胺反应：样品溶于冰醋酸中，加入乙酰及氯化涕结晶数粒，稍加热，则呈现淡红色或紫红色七.甾体化合物根据C17侧链不同分为。21甾(羰甲基化合物)、强心苷(不饱和内酯环)和甾体皂苷三类(含氧螺杂环)成分 强心苷元分为甲型强心苷元(五元环)和乙型强心苷元(六元环)强心苷苷键的水解1.由于2-去氧糖的存在强心苷在很温和条件下可发生苷键的裂解。苷兀和a-去氧糖、a-去氧糖和a-去氧糖之间的糖苷键极易被酸水解，在此条件下即能被切断。但由a-羟基糖形成的苷键则难以水解。不会引起苷兀缩水。2剧烈酸反应但结构中无2-去氧糖，则需在强烈条件下水解。引起苷兀脱水形成缩水苷兀。盐酸丙酮法糖分子中C2-oH和C3-OH与丙酮反应，生成丙酮化合物水解得到苷兀和糖的衍生物。酶催化水解蜗牛消化酶几乎能水解所有苷键强心苷的显色反应：(1)a、0不饱和内酯环的显色反应可用于区别甲型强心苷与乙型强心苷。a、目不饱和内酯环的显色反应，甲型强心苷再碱性醇溶液中，生成C-22活性亚甲基，能与活性亚甲基试剂作用而显色。乙型强心苷在碱性醇溶液中不能产生活性亚甲基，无此类反应。(2)a二去氧糖的显色的反应，如Keller—Kiliani(KK)反应.这一反应是a-去氧糖的特征反应，游离的a-去氧糖才能呈色。苷元与由1分子a-去氧糖和葡萄糖或其他羟基糖相连接的双糖、叁糖所组成的强心苷，在此条件下不会水解出游离的a-去氧糖而不呈色。皂苷的颜色反应1.醋酐-浓硫酸(I,iehermann—Rurchard)反应可用以区别甾体皂苷和三萜皂苷甾体皂苷最后呈蓝绿色，三萜皂苷最后呈红色或紫色。2.三氯醋酸反应将甾体皂苷样品的氯仿溶液滴在滤纸上，加三氯醋酸试剂，加热至60C，生成红色渐变为紫色。在同样条件下，三萜皂苷必须加热到100C才能显色。。可用于区分三萜皂苷和甾体皂苷。甾体的结构