蛋白多肽类药物和单抗药物免疫原性评价方法及研究进展

蛋白多肽类药品和单抗药品免疫原性评价办法及研究进展作者｜王慧敏，闻镍，王晓霞，刘丽，刘会芳内容来源｜中国医药生物技术.06免疫原性是指药品刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质[1]。许多生物药品在体内都含有免疫原性，对动物或人予以蛋白多肽类药品或单克隆抗体（简称单抗）药品后可能会引发机体产生抗药品抗体（anti-drugantibody，ADA）。ADA会对药品暴露、药品代谢动力学特性、药效、药品毒性作用等造成影响，重要涉及：ADA与药品结合，可能增加或减少药品的去除、影响血浆半衰期和组织分布、变化药品的暴露水平和药代动力学特性ADA减少药品暴露水平可能使非临床毒理研究中药品毒性作用被部分掩盖，影响对药品毒性作用的评价及对临床研究中起始剂量的评定；中和抗体（neutralizingantibody，NAb）会中和药品的活性，减少药品的药效作用；ADA与药品及内源性同系蛋白结合后，可能会造成该蛋白缺点综合征，起对应毒性作用；对药品的免疫应答可能会造成过敏反映、本身免疫等，ADA-药品免疫复合物沉积可能引发免疫病理变化和有关不良反映。因此，在非临床药代动力学、药理和毒理研究中评价免疫原性有助于对研究成果作出更加合理的解释，是生物药申报临床实验的重要内容。同样，免疫原性评价也是蛋白多肽类药品和单抗药品临床研究中重要的评价项目，是监管部门关注的重要内容。在生物类似药品研发中，也是进行相似性比对的重要指标之一。EMA、FDA、NMPA有关技术指导原则中都规定检测这类药品的免疫原性，检测的规定越来越严。蛋白多肽类和单抗药品免疫原性评价重要涉及鉴定ADA的存在与否、ADA水平（抗体滴度）、与否含有中和能力、抗体产生比例和发展变化状况等。有多个办法和技术可用于ADA检测。蛋白多肽类和单抗药品由于给药剂量大、半衰期长，循环中的高浓度药品给免疫原性的评定带来了很大挑战。另外，可溶性靶标的存在也会给单抗药品免疫原性检测带来较大干扰。如何减少这些干扰，确保检测成果的精确性、敏捷度、特异性和可靠性是现在ADA和NAb检测办法亟需解决的问题。本文对惯用的ADA和NAb检测办法、检测中存在的问题、已有解决办法及其研究进展进行综述，为蛋白多肽类药品和单抗药品研究开发和应用中免疫原性的评价提供办法参考。1ADA的检测ADA的检测和表征常采用多层次办法。检测普通涉及筛选实验和特异性确证明验；表征实验普通涉及抗体滴度测定、亚型测定和中和抗体检测。冻干制剂核心技术:处方工艺研究、工艺放大与验证及案例分析ADA检测实验需要两个核心的决策参数，分别为筛选临界点和特异性临界点[2]。筛选临界点即筛选实验中判断样品为阴性或阳性的响应水平[3]，等于或高于筛选临界点的样品为阳性样品。相反地，若低于筛选临界点，则判断该样品为阴性样品。一种有效的筛选临界点需要在预研究验证阶段对一系列样品测定值进行系统性的统计分析，然后才干拟定。普通状况下，一定比例的假阳性成果比没有假阳性成果好，能够允许约5%的筛选实验阳性成果为假阳性，以确保能够检测出弱阳性样品。同时，规定所使用的样品可代表使用目的群体或受试者。特异性临界点是能够区别抗药抗体与药品与否特异性结合的值，其有效性非常核心，必须客观评定。不建议使用50%信号克制等主观原则，信号略高于临界点的抗药抗体弱阳性样品的评价尤为重要。抗药抗体的表征实验中抗体滴度的测定，普通表达为，能够产生阳性成果的最低浓度，或者说最大稀释倍数；亚型测定即检测抗药抗体所属IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM中的哪一种亚型；中和抗体的检测即为检测ADA中与否有能够中和药品活性的抗体。1.1ADA检测分析办法1.1.1ADA检测惯用分析办法惯用办法涉及酶联免疫法（ELISA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等离子体共振法（SPR）、电化学发光法（ECL）、全自动纳升级免疫分析工作站（Gyrolab）等。免疫原性筛选普通使用操作方便快捷、能够高通量测定的ELISA办法。桥式ELISA办法最为惯用，该办法是运用包被在酶标板上的抗体药品捕获血清样品中的ADA，然后加入生物素标记的抗体药品，使其与ADA结合。接着用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联试剂作为检测试剂，加入酶反映底物显色后，再运用酶标仪进行检测。此法的优点是能检测各类抗体的亚型，可高通量检测。但此法不易检测到低亲和力的抗体，在包被或标记药品时可能会掩盖或者变化药品的抗原表位，并且检测时也容易受到药品本身的干扰[4-5]。RIPA法是以放射性标记的抗原或抗体通过免疫沉淀检测ADA。优点是中档或高通量水平，普通敏捷度高、特异性强、操作简便、样品及试剂用量少。但缺点是该办法中标记抗原的比活度和放化纯度必须足够高，并且所使用放射性同位素的半衰期也必须足够长，否则有部分抗体无法被检测到，造成定量不准。并且同位素含有潜在放射性危害，同位素标记还会影响表位的暴露，标记药品非特异性地夹带在沉淀物中，相对于固相表面，结合力较弱。SPR技术是将药品偶联在传感器芯片上，其可与样品中的抗药抗体结合[6]，使传感器能够间接检测到抗药抗体，最后通过系统拟合的结合曲线对ADA进行定量分析。该办法的优点是可实现实时、无标记检测，并且快速、敏捷、操作简便，能检测到不同亲和力的抗体和各抗体亚型；缺点是所用试剂通用性差，通量低。ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反映，可用磁珠或者石墨电极板作为反映载体。将生物素标记的药品与链霉亲和素包被的微磁珠或石墨电极板相结合，运用该药品去捕获样品中的ADA，然后再加入钌标记的药品，使其与ADA结合。形成免疫复合物后，以磁珠为载体的实验运用磁场吸附磁珠，并用ProCell（在免疫分析系统中产生电化学信号的系统溶液）溶液将结合了磁珠的免疫复合物与未结合的组分分离，最后施加电压启动反映，激发钌发出光信号，通过采集光信号，并将光信号转化成ADA浓度，得以实现对ADA的定量。而以石墨电极板作为反映载体的实验，将电极表面通电后，通过电化学作用激发钌标记物发出强光，同样通过检测光信号进行ADA的定量[7]。ECL法精密度高、敏捷度高、线性范畴宽、检测时间短、反映体系可控、样品用量少、通量高，缺点是需制备2种标记物（生物素标记的药品和钌标记的药品），需要确保标记物足够稳定，所用试剂通用性差。使用Gyrolab平台进行免疫原性检测，采用自动化进样方式，将传统的双抗夹心大分子检测办法与微流控CD技术结合在一起，CD微构造中装有链霉亲和素包裹的微珠填料，通过生物素捕获试剂，与样本特异性相结合，再与带荧光团的检测试剂结合，用工作站中的激光激发荧光，并用检测器对吸附在样本上的荧光标记物进行读数。该技术已经被广泛用于生物分析中的配体结合实验[8]。该技术的优点是自动化、通量高、节省时间、试剂盒样品用量少、检测范畴广、基质效应低。专用的GyrolabADA软件还能够协助拟定筛选临界点和确证临界点。1.1.2ADA检测新兴分析技术为满足越来越严格的评价原则的规定，涌现出某些新兴ADA检测分析技术。免疫PCR法（Im-PCR），首先将ADA与固相上的药品及生物素化药品结合，从而形成“药品-ADA-生物素化药品”的桥梁，然后加入抗生物素-DNA复合物作为检测试剂，通过扩增DNA，间接对ADA进行检测[9-10]。该办法也是在ELISA的基础上建立起的，用PCR扩增替代ELISA的酶催化底物显色[11]。PCR含有很强的放大能力，能够检测稀释后的ADA，不仅可减少基质效应，还含有非常高的敏捷度和特异性。与对应的ELISA比较，Im-PCR可使ADA检测的敏捷度提高约1000倍，并且本法中仅仅采用稀释的办法就能够消除生物样品中基质的干扰[11]。SingulexErenna是基于单分子检测技术（SMC）的免疫检测系统，原理与传统的ELISA很相似，只是在捕获和检测环节，药品将每个ADA转化成信号。在洗脱环节，荧光素标记的检测抗体从免疫复合物中解离下来，洗脱物被送入Erenna系统的毛细管中，毛细管上有一种非常微小的检测空间可供激光照射。通过检测空间时，单个的荧光素标记抗体能够产生荧光闪烁，从而被检测到。SMC技术在获得最优化的免疫检测效力的同时，操作流程相对更为简便，该技术通过整合独特的洗脱环节和敏捷的数字化检测，相较于传统免疫检测技术，信噪比有了很明显的改善，实现了能够在一种系统里同时检测低水平和高水平的ADA。SQISquidLite技术能够在活化的玻璃表面上打印药品的微阵列斑点[12]，加入待测样品后，ADA就会与药品结合，再用荧光标记的抗体结合ADA，通过检测荧光强度对ADA进行分析。该平台实现了在同一孔中进行ADA及其亚型的检测，能够避免多次检测带来的样本量的损耗。该技术与ELISA或ECL相比，有更高的敏感性和耐药性。它的重要优势体现在，当需要进行检测抗体分型时能够多路复用，自动化系统还含有高通量特性。然而该平台使用专用缓冲器，前期需要大量成本。GenalyteMaverick系统也能够实现同时检测ADA及其亚型。该技术平台，将药品捕获探针印刷在硅光子生物传感器表面，样品中的ADA会被药品捕获，使用结合在链霉亲和素包被珠上的生物素化药进行检测，由于珠子的加入变化了原样品溶液的折射率，然后根据折射率的变化，就能够测定ADA[8]。该系统能够检测全部免疫球蛋白亚型，涉及单价的IgG4。然而该平台规定样品进行酸解离预解决，然后用包被在96孔板上的药品亲和捕获ADA，ADA要在低pH下洗脱和中和。SQISquidLite技术和GenalyteMaverick系统都有可自动化的优势，但是后者不需要标记，并且能够进行实时动态读取成果，而前者只有最后的成果读数，并且现在使用较少。1.2ADA检测中重要干扰因素及解决办法1.2.1样品基质中循环药品的干扰及解决办法免疫原性检测，会受到样品基质中循环药品的干扰，过量的药品与ADA结合，会造成ADA检测假阴性成果。现在ADA分析中有多个办法来提高药品耐受性，减少或避免由于游离药品的存在造成的假阴性成果，避免对ADA的低估。由于ADA在样品中会有两种存在形式，即游离ADA和ADA-药品复合物[13]。游离的ADA相对比较容易检测到，想要同时检测与药品结合的ADA，单独运用上述某一种办法或技术平台难以实现。为了克服ADA检测过程中受到的多个干扰，需要对样品进行预解决，现在重要的预解决办法有吸附小柱去除游离药品、酸解离或碱解离（绝大多数状况下为酸解离）、磁珠提取和酸解离（BEAD）、固相提取和酸解离（SPEAD）等办法。1.2.1.1吸附小柱去除游离药品吸附小柱可与药品特异性结合的物质（抗人IgG单克隆抗体或多克隆抗体）与固相载体（琼脂糖树脂、磁性颗粒、芯片或微流体）偶联，该物质不与样品中除游离药品之外的其它成分反映，可特异性地结合待测样品中的游离药品，能够使其后的ADA检测中（如使用桥接ELISA法）避免游离药品与标记试剂竞争结合待检测的ADA所致的干扰，涉及对ADA检测的低估或假阴性成果[14]。这个办法不仅有效地减少了药品对抗药抗体检测的干扰，同时还提高了检测敏捷度。但该办法只是去除样品中游离的药品，而已经与ADA结合的药品难以去除，药品-ADA复合物仍旧会影响检测成果[药研公众号整顿排版]。1.2.1.2酸解离酸解离是较为常见的预解决手段[5]。具体地说，酸解离是通过酸化样品来实现将ADA-药品复合物解离成ADA和药品，但这仅是在酸性条件下的存在形式，酸化后的样品需要在pH回到中性时方可被用于ADA的检测。此时，样品中的部分药品和抗药抗体又重新形成ADA-药品复合物。并且，酸解决能够分解药品-靶点复合物，可能会将游离靶点释放到样品基质中，造成假阳性成果。但酸解离的最大目的是使得原来已与药品结合的抗药抗体最少有部分能够被检测到，如果不采用酸解的话，可能检测不到ADA。在使用酸解离解决样品的ECL检测办法中，即使酸化后样品中的抗药抗体在中性pH条件下，仅仅只有部分会同时与电极板微孔中生物素化的药品以及钌标记的药品结合，但仍然可被检测出来。在所用酸解试剂不影响ADA性质的前提下，此办法简朴，易操作。1.2.1.3BEAD和SPEADBEAD法与SPEAD法原理相似，两者均是在载体上包被链霉亲和素以结合生物素-药品偶联物，差别在于BEAD法提取ADA的载体是磁珠，SPEAD法提取ADA的载体是链霉亲和素包被的石墨电极板或酶标板[15-18]。在这两种办法中，药品-ADA复合物在低pH条件下解离，当溶液中和后，加入生物素-药品偶联物，与游离药品竞争结合ADA，生物素-药品偶联物与ADA结合后被捕获在链霉亲和素包被的载体（磁珠或板）上。捕获的ADA再次在低pH条件下解决洗脱，然后进行检测。相对而言，SPEAD法含有操作简朴和材料价格较低的优势，但与磁珠相比，板的结合能力相对较低。根据本实验室经验，同样条件下，BEAD法得到的检测成果相对稳定，易重复。1.2.1.4沉淀和酸解离Zoghbi等[19]开发了一种突破性的新办法，即采用沉淀和酸解离（PandA）相结合的办法来克服ADA检测中的药品干扰。该办法的原理是将过量的药品添加到含ADA的血清样品中并孵育，以形成ADA-药品复合物。初次孵育后，在样品中添加PEG并孵育以使复合物沉淀。对沉淀进行一系列洗涤，最后一次洗涤后，将沉淀用乙酸解离，使ADA-药品复合物解离成ADA和药品，并直接包被到石墨电极板上。孵育后，将板封闭，然后加入钌标记的药品与包被的ADA结合，通过ECL办法对ADA进行检测。在他们的办法中，分别使用了人源化IgG1、全人源IgG4和人源化IgG4单抗药品进行实验，均证明了该办法的合用性。然而本实验室在实际应用该办法时发现，由于操作环节较多，分离沉淀和上清液难度也较大，而PEG的浓度也会影响敏捷度和特异性，因此不拟定因素较多，造成重复性较差。1.2.2基质中可溶性靶标的干扰及解决办法对于单抗药品，可溶性靶标的干扰也是一种特别含有挑战性的问题。可溶性的二聚体或多聚体药品靶标能够在两个标记药品分子之间形成桥梁，容易造成ADA假阳性成果。单克隆抗体药品ADA检测中，对于可溶性靶标的干扰问题，现在普通采用的解决办法是将基质中的可溶性靶点进行去除，普通能够用靶点克制剂（普通为对应的抗靶点抗体）去结合靶点，可去除靶点的干扰作用，提高靶点耐受性[20]。1.2.3基质中类风湿因子的干扰及解决方法类风湿因子（RF）是以变性的IgG的Fc片段为靶抗原的本身抗体，RF不仅可与变性的IgG结合，也与本身IgG或异体IgG反映，常对免疫检测造成干扰。在检测ADA时，如果用的捕获抗体和检测抗体均为IgG，样本基质中的RF能同时与两者结合，形成捕获抗体-RF-检测抗体复合物，从而产生ADA假阳性。而当RF只能与其中一种抗体结合时，又会造成空间位阻，造成假阴性成果的产生。对于存在RF干扰的样本，可通过对样本进行前解决以消除或尽量减少其干扰。惯用的办法涉及：分析前在样本中加入动物血清或IgG，或加入封闭阻断试剂；用包被IgG的固体颗粒吸附；使用阻断试管采集样本等[21]。前文所述的检测办法和平台多数都较为传统，普通都是在前解决过程中将ADA-药品复合物分开，然后单独检测ADA。与否能够实现在ADA-药品复合物不分开的状况下检测ADA，值得进一步探究。2NAb的检测药品的中和抗体指能够中和药品活性的抗药抗体，单抗药品的中和抗体是与单抗互补决定区（CDR）特异性结合的抗药抗体[22]。在某些状况下，NAb还能够与内源性对应物发生交叉反映，从而造成某些正常生理功效受损和危及生命的副作用。因此NAb的表征已经成为评定生物技术药品安全性和有效性的重要要素。2.1NAb检测办法NAb检测普通分为两类：基于细胞的分析检测（CBA）和竞争性配体结合分析检测（CLBA）[23]。CBA办法使用体现药品预定靶点的细胞，样品中的NAb制止了药品与其靶点结合产生的细胞效应，从而根据细胞效应削弱的程度进行NAb分析；CLBA办法是通过评价可溶性靶点和样品中NAb对药品的竞争性结合，再结合ELISA或ECL平台进行NAb检测。对于NAb检测，监管机构推荐基于细胞的分析检测作为首选办法，由于细胞反映更能反映NAb在体内对药品的影响[3]。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是一种常见的治疗性抗体药品的作用机制。Wu等[23]建立、优化了一种基于ADCC的NAb检测办法，用该办法来检测贝那利珠单抗予以人后诱导的NAb。其原理是贝那珠单抗与靶细胞上的人IL-5R结合，并且贝那珠单抗的Fc区通过CD16与效应细胞结合，从而诱导靶细胞的ADCC。ADCC活性与荧光素酶报告基因的激活亲密有关。在含有NAb的血清样品中，ADCC就会被NAb克制，造成荧光素酶信号（RLU值）减少。产生的荧光素酶信号与样品中存在的NAb数量成反比。即使该办法药品耐受性和敏捷度都不是很高，但用于检测临床样本是可行的。美国瑞泽恩制药公司发明了用于检测中和抗体的竞争性配体结正当[24]，该办法简朴来说涉及下列环节，首先要获取样品，然后在捕获试剂（普通为生物素标记的治疗性蛋白药品）存在下孵育样品，最后加入检测试剂。其中相对于对照样品减少的信号批示针对蛋白多肽或单抗药品的中和抗体存在。该办法敏捷度较高，特异性较强，动态范畴较广，检测时间较短，有相对更高的药品耐受性。Wu等[23]曾通过检测贝那利珠单抗的中和抗体对比了CBA与CLBA两种办法在检测NAb时精密度、敏捷度以及药品耐受性等方面的差别。CLBA与CBA批内变异相称，与CBA相比，CLBA批间变异相对小得多，因此CLBA比CBA精密度更高。CLBA对单克隆ADA阳性对照及多克隆ADA阳性对照的检测敏捷度也相对较高。另外，尽管两种办法的药品耐受性都是有限的，但CLBA药品耐受性约为2.5倍（可检测到的NAb浓度与药品浓度比），而CBA则只有1.6倍，因此CLBA药品耐受性同样相对较高。Hu等[25]在3项临床研究中也进行了CBA和CLBA法的对比，其中两项研究成果表明CBA和CLBA检测中和抗体的能力相称，在第三项研究中，CLBA体现相对较差。由此可见，无论是CBA还是CLBA，都有本身的优势和局限性，应根据每一种药品独特的作用机制、免疫风险评定以及技术可行性评定去选择和设计NAb检测办