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文档简介

PCR扩增目的DNA片段聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是1985年由KaryMullis发明的。

DNA的复制(replication)

——

由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。

复制亲代DNA子代DNA

一、PCR的基本原理变性退火延伸72℃Taq聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Thermusaquaticus）内，故命名为Taq聚合酶（Taqpolymerase），也称为TaqDNA聚合酶，简称Taq酶或Taq。DNA模板95℃（解链）60℃（退火）与引物结合72℃（延伸）DNA单链引物Taq酶，dNTPs,Mg2+模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段

的酶促合成反应。二、操作步骤：（以3－磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的扩增为例,目标片段815bp）1、PCR体系ReagentsVolume(ul)ddH2O（DEPC）2.5PCRBuffer2.5Mg2+2.5dNTPs 2.5GAPDHprimerF2.5GAPDHprimerR2.5Taqpolymerase2.5cDNAtemplate2.5Totalvolume20瞬时离心后2、反应条件：预热：95℃3min；

解链：95℃30s；

退火：60℃30s；28个循环

延伸：72℃45s；

再延伸：72℃5min；

保存：12℃99min3、准备1%琼脂糖凝胶4、加样：延伸完毕后即可取出样品，取8ulPCR产物加入2ul6×loadingbuffer于新的一支0.5ml的Ep管中，瞬时离心后，加入10ul样品到琼脂糖凝胶中。（ps:剩余PCR产物保留至下一酶切实验用）MS5、电泳：

120V,电泳20min6、染色：

EB染3min，自来水清洗一次7、观察：凝胶成像系统照相

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