生物化学与分子生物学实验技术-第一次(分光 层析)

生物化学与分子生物学实验技术ExperimentaltechnologyofBiochemistryandmolecularbiology《生物化学与分子生物学》《生物化学与分子生物学实验技术》理论考试（60分）实验成绩（40分）理论课：3学时

×3次实验课:6学时

×6次操作考试：3学时学时考试3.5学分2.5学分《生物化学与分子生物学实验技术》成绩分布理论考试（60分）：选择题（15题，15分）判断题（15题，15分）填空题（15个空，15分）论述题（1题，15分）实验成绩（40分）:实验操作考试（10分）实验报告（15分）实验讨论（10分）考勤和卫生（5分）Thebasicexperimentaltechnology：一、分光光度技术二、层析技术三、电泳技术四、离心分析技术五、PCR技术六、蛋白分离和纯化技术

一、分光光度技术

(Spectrophotometry)

722型分光光度计的旋钮上标示的0、100、A、T分别表示什么意思？分光光度法检测物质浓度时为什么要用空白液？将两个空比色杯放入分光光度计，以一个比色杯作为对照，测另一个比色杯的吸光度。Contents：一)光的概述二)分光光度法的概念及原理四)测定物含量的计算三)分光光度计的构造及使用方法一)光的概述（lightwave）1.光的性质光是电磁波，通常用波长、频率来描述不同的光波。波速=波长×频率

不同波长(或不同频率)的电磁波在相同介质中的传播速度都相同，电磁波的频率愈高，波长越短。一定波长的光具有一定的能量，波长越长（频率越低），光量子的能量越低；反之，波长越短（频率越高），光量子的能量越高。溶液的颜色与吸收光颜色的关系紫外光：＜400nm可见光：400～760nm红外光：＞760nm

另根据电磁波的波长不同又分为三个波段：可见光：电磁波谱中人眼可以感知的部分，波长在400到760纳米之间，往往是具有颜色的光。实验证明：白光(日光、白炽电灯光、日光灯光等)就是由以上不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。白光叫做复合光；只具有一种颜色的光/同一波长的光叫做单色光。溶液的颜色与吸收光颜色的关系

为什么以上多种有颜色的单色光混合在一起即变为白光？互补光（complementarycolors）：——把适当颜色的两种光按一定强度比例混合能成为白光，这两种颜色的光称为互补光。2.介质对光波的吸收光在介质内传播时，介质中的束缚电子在光波电场作用下做受迫振动，光波要消耗能量激发电子的振动，导致介质中的分子（或离子）由基态跃迁到高能级的激发态。光的吸收：是指原子在光照下，会吸收光子的能量由低能态跃迁到高能态的现象。只要是介质，就会吸收各种光波？介质吸收光的条件：而物质的基态和激发态是由物质的原子构成和原子间相互作用决定的，不同物质由于其分子结构不同，导致物质能态的不同，对光的选择性吸收也就不一样。入射光的能量=介质中物质的基态和激发态能量差溶液的颜色与吸收光颜色的关系白光(红、青；橙、青蓝；黄、蓝；绿、紫；

)物质吸收光能的多少与什么有关系？用眼睛观察、比较溶液颜色深度以大致估计物质含量的方法称为目视比色法。利用物质能吸收光能的原理以精确测定物质含量的方法——分光光度法Cu2＋二)分光光度法的概念及原理1.分光光度法的概念

当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量有部分被吸收而部分被透过，所以光线射出溶液介质后光能被减少。这种利用光能的吸收和透过比例来进行某些物质的定性定量分析。

1.灵敏度高

分光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度)一般可达1-10-3%的微量组分。2.分光光度法的特点2.准确度较高

一般分光光度法的相对误差为2-5%。3.操作简便，测定速度快4.应用广泛

几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用分光光度法进行测定。入射光I0

吸收Ia

透射It

I0=Ia+It+IrI0=Ia+It1.透光率(T)和吸光度(A)

3.分光光度法的原理透光率(transmittance)

T

=It/I0吸光度(absorbance)A2.Lambert-Beer定律（1）Lambert定律:

（2）Beer定律:

（3）Lambert-Beer定律:K为吸光系数，对于一定物质的溶液K为常数。A=KLA=KCA=KCLtC一定,A∝LL一定,A∝c三)分光光度计的构造及使用

能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。

紫外光分光光度计

可见光分光光度计

红外光分光光度计

万用（全波段）分光光度计透射光能722型（触摸键式）722型（旋钮式）可见光分光光度计：722型（触摸键式）1.开电，预热20分钟；2.调“λ”——选择所需波长波长旋钮

原理：将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。透射光能光路722型（触摸键式）1.开电，预热20分钟；2.调“λ”——选择所需波长3.装液（2/3）透射光能吸收池：比色皿用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm。可见光分光光度计——玻璃比色皿紫外光分光光度计——石英比色皿检测器：检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。光能电能透射光能透射光能显示装置：把放大的信号以吸光度A或透光率T的方式显示或记录下来。

分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。透射光能吸收池：比色皿用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm。可见光分光光度计——玻璃比色皿紫外光分光光度计——石英比色皿722型（触摸键式）1.开电，预热20分钟；2.调“λ”——选择所需波长3.装液（2/3）4.功能键置“T”——调“T”为0（遮光体对准光缝）功能键722型（触摸键式）1.开电，预热20分钟；2.调“λ”——选择所需波长3.装液（2/3）4.功能键置“T”——调“T”为0（遮光体对准光缝）5.功能键置“T”——调“T”为100（空白管对准光缝）6.功能键置“A”——依次拉动拉杆（听到“咔”一声）比色、读数并记录（A值取三位有效数值）7.洗涤比色皿功能键722分光光度计使用注意事项：1.样品室盖应轻开轻放；2.比色皿拿磨砂面，液体装入约2/3高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上；3.倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品；四）测定物含量的计算标准管法标准曲线法1.标准管法空白管(B)标准管(S)测定管(U)1/20稀释血清标本（ml）－－1.01/20稀释标准血清（ml）－1.0－生理盐水（ml）1.0－－双缩脲试剂（ml）4.04.04.0参比（空白）溶液blank：参比溶液的作用：扣除一切不来源于目标产物的光吸收。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。StandardsampleUnknownsample

1.标准管法空白管(B)标准管(S)测定管(U)1/20稀释血清标本（ml）－－1.01/20稀释标准血清（ml）－1.0－生理盐水（ml）1.0－－双缩脲试剂（ml）4.04.04.0As=KsCsLsAu=Ku.Cu.LuAsKsCsLsAuKu.Cu.Lu=As.Cs.AuCu.=2.标准曲线法试管12345浓度（C=µg/ml）1020304050吸光度（A）0.0710.1550.2230.2720.366将AU=0.186代入公式y=139.6x-0.647求得CU=25.3µg/ml二、层析技术ChromatographyTechniqueContents:一)层析技术的概念二)层析技术的原理三)层析技术的分类四)凝胶层析技术一）层析技术的概念利用混合物中各组分的物理化学性质差异，使各组分在层析系统中以不同速度移动而达到分离的一种物理分离方法。混合物ABCD二）层析技术的原理理化性质：吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。利用混合物中各组分理化性质差异进行分离;固定相流动相——固定不动（液/固）——针对固定相（相对运动）（气/液）推动样品中各组分通过固定相向前移动层析系统当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。（1）按两相所处的状态分类：三）层析技术的分类液相色谱

气相色谱

固定相流动相——固定不动（液/固）——针对固定相（相对运动）（气/液）层析系统液-固层析液-液层析气-固层析气-液层析——高效液相色谱(HPLC)柱层析纸层析薄层层析（2）按操作形式不同分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的

分配系数（或溶解度）不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。（3）按层析原理分类：四）凝胶层析技术优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等。因此凝胶层析技术广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。凝胶层析：凝胶颗粒多孔板——凝胶（琼脂糖/葡聚糖/聚丙烯酰胺）——液体（洗脱液）固定相流动相多聚葡萄糖与环氧丙烷交联原理：混合物中各组分按其分子颗粒大小不同而被分离的技术。凝胶层析又称分子筛层析分离鉴定不同分子量大小的蛋白质用什么方法？影响凝胶层析效果的因素：

1．层析柱的选择

层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。层析柱的直径和长度比一般在1：25～1：100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。品名干胶颗粒直径/μm得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量／Da线性葡聚糖分子质量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超细40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超细40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超细40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超细40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-20000