中药单体组方梓葛冻干粉对缺氧复氧损伤的保护作用

中药单体组方梓葛冻干粉对缺氧复氧损伤的保护作用

子葛冷冻粉末是实验室根据自己创造的抗脑缺血兵中药物的复方。它由“千金方”治疗中风著名方剂羌活汤的主要成分是子醇和葛根素。该处方和制备技术在获得国家技术专利申请后得到了批准。课题组既往研究表明,梓醇能够促进离体培养的原代皮质神经元轴突生长,促进脑缺血大鼠缺血周围区皮质血管新生,同时改善脑血管内皮细胞肿胀,并能显著改善局灶性永久性脑缺血大鼠神经功能。葛根素具有神经保护作用,减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,改善神经行为活动。梓葛冻干粉具有抗大鼠大脑中动脉栓塞永久局灶性脑缺血的作用,可显著减少脑梗死面积,改善模型动物运动功能。缺血性脑卒中是一个复杂的病理过程,涉及到自由基损伤、能量代谢障碍、炎症反应、细胞凋亡等方面。血管内皮细胞是缺血/再灌注损伤中自由基和多种损伤性因子作用的重要靶点,血管内皮细胞受损活化是缺血/再灌注损伤病理演变过程中的关键环节。依据机体内皮细胞缺血/再灌注损伤过程中组织间液的变化(包括缺氧、乳酸堆积、酸中毒和糖耗竭等)和人脐静脉内皮细胞与人体生理的相似性和可获得性,本实验采用Krebs液制备人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤模型,模拟整体动物的缺血/再灌注损伤过程,观察梓葛冻干粉对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧模型损伤的保护作用,并初步探讨其作用机制,为梓葛冻干粉治疗脑缺血卒中提供主要药效学实验依据。1材料表面1.1-actin抗体梓葛冻干粉由西南大学中药研究所提供,主要成分为梓醇和葛根素,批号为20100512;DMEM培养基购自Gibco公司;Hyclone血清购自北京赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司,批号NVM0347;Bcl-2,Bax,Caspase-3,GAPDH,β-actin抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;ECL化学发光试剂和PVDF膜购自Millipore公司;一氧化氮(NO)测试盒(批号20100902),丙二醛(MDA)试剂盒(批号20100728),超氧物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20100728),乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号20100312),均购自南京建成生物工程研究所;胰蛋白酶,四氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司。尼莫地平购自德国拜耳医药保健有限公司,批号J20100002;其余试剂如二甲基亚砜(DMSO)、盐酸等均为进口分装或市售分析纯。1.2紫外分光光度计CO2培养箱(美国NACPO6000);电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统(Bio-Rad);紫外分光光度计(日立高新U-3010);纯水系统(Millipore);高速冷冻离心机(Eppendorf5417R);超低温冰箱(Thermo);倒置显微镜(德国ZissIX71),酶标仪(美国BioTekElx800),缺氧装置乃本实验室自制。2方法2.1格局生物—体外缺血再灌注模型的建立模型参考文献方法并加以改进。人脐静脉内皮细胞株(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs,购于中国科学院上海细胞生物学研究所)常规培养48h后,弃掉培养基,用D-Hanks液冲洗2次,将所有孔换成无血清缺氧培养液(Krebs液),放入经95%N2,5%CO2的混合气饱和的密闭自制缺氧容器中,同时继续通入95%N2,5%CO2的混合气,37℃培养4h,然后取出培养板,将缺氧培养液换成复氧培养液后于37℃,5%CO2条件下复氧培养2h。2.2复氧时剂量的确定(1)正常对照组:细胞在37℃,5%CO2条件下培养;(2)缺氧/复氧模型组:细胞在给予上述缺氧处理4h后再于37℃,5%CO2条件下培养2h;(3)尼莫地平组:在复氧时加入2.1mg·L-1的尼莫地平,其余过程同模型组;(4)梓葛冻干粉组:在复氧时分别加入49.0,24.5,12.5mg·L-1的梓葛冻干粉,其余过程同模型组。梓葛冻干粉和尼莫地平均以0.9%的生理盐水溶解,分别按49.0,24.5,12.5,2.1mg·L-1加入培养基中。在复氧时,各给药1次。同时对照组和模型组给予相同体积的0.9%生理盐水。每组均设复孔6个。2.3dmso检测a采用MTT法。吸弃培养基,PBS洗3次,96孔板每孔加入5g·L-1的MTT溶液各15μL,于培养箱中37℃,5%CO2条件下孵育4h后,弃去MTT液,每孔加入100μL的DMSO,振荡器轻轻混匀10min后,以酶标仪490nm波长检测A。2.4mda,no含量和sod活性检测复氧2h后,弃去培养基,用PBS洗涤2次。加入300μL细胞裂解液于冰上裂解30min后,高速冷冻离心机离心10min,取100μL细胞上清液按试剂盒说明书操作,用硫代巴比妥酸显色法、硝酸还原酶法和黄嘌呤氧化酶法分别测定细胞MDA,NO含量和SOD活性。2.550.50ldh释放量的测量复氧2h后,取细胞培养上清液,按试剂盒说明操作,用2,4-二硝基苯肼显色法测定LDH释放量。2.6细胞裂解液的制备参照文献方法,将收集的细胞离心沉淀,吸干水分后,加入150μL冰冷的细胞裂解液于冰上匀浆,冰浴30min;4℃下12000×g离心10min;取上清(含胞膜和胞浆裂解物)置于4℃预冷的Ep管中,液氮速冻,-70℃保存备用。用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。2.7分离蛋白的制备取细胞裂解液上清,分别加入5×上样缓冲液于沸水浴中加热5min后离心,加入已灌制好的10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白,每泳道上样40μg;电泳结束,将分离蛋白转印至PVDF膜;TBST洗膜,随后将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中,室温封闭1h,然后用一抗工作液孵育,4℃过夜(16~18h);TBST充分洗膜后,用HRP标记二抗工作液37℃孵膜;TBST洗膜,将膜移入ECL工作液中,显影,压片,用Quantityone4.5.1版图像分析软件(Bio-Rad公司产品)分析条带的吸光度,以目标蛋白与内参条带比值作为目标蛋白相对表达量,试验重复3次。3结果3.1各组葵、鱼、葛冻干粉的比较缺氧/复氧后,模型组A低于对照组(P<0.05);与模型组比较,12.5mg·L-1的梓葛冻干粉显著高于模型组(P<0.05);49.0,24.5mg·L-1梓葛冻干粉组与模型组相比没有显著性差异。3.2尼莫地平-1和学习葵、腈葛冻干粉治疗mda的活性缺氧/复氧损伤后,模型组MDA和NO含量以及LDH释放量均显著性升高(P<0.05),SOD活性显著性降低(P<0.05)。药物干预后,尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛冻干粉24.5,12.5mg·L-1能显著降低MDA,LDH和NO含量(P<0.05);尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛冻干粉的各剂量均能显著提高SOD活性(P<0.05)(表1)。3.3caspase-3和bcl-2蛋白表达水平检测Westernblot结果显示,缺氧/复氧损失后,Caspase-3和Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著下降,Bcl-2/Bax显著降低(P<0.01);药物干预后,尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛冻干粉49.0,24.5mg·L-1组Caspase-3蛋白表达水平显著低于模型组(P<0.01);尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛冻干粉24.5,12.5mg·L-1组Bcl-2蛋白表达水平显著高于模型组(P<0.05,P<0.01);同时,尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛冻干粉49.0,24.5,12.5mg·L-1显著降低Bax蛋白的表达并上调Bcl-2/Bax(P<0.05,P<0.01)(表2,图1)。4同型：葛冻干粉对huvd活性的影响脑缺血再灌注损伤时,内皮细胞受损可使内皮依赖性舒张血管的物质(如NO)生成减少,加速脑缺血性损伤。Yang等研究发现CYP4502J2过表达的牛主动脉内皮细胞,可拮抗缺氧/复氧损伤。梓葛冻干粉是否通过保护内皮细胞拮抗脑缺血/再灌注损伤值得探讨。近年研究发现,梓醇能够阻止线粒体膜电位的丧失,提高内源性抗氧化能力,降低自由基生成,从而抑制多巴胺神经元损伤。葛根素对小鼠的缺氧损伤具有显著延长存活时间的作用,以及对小鼠缺氧后再暴露所引起的脂质代谢产物丙二醛的产生也有显著的抑制作用。实验中缺氧/复氧后,LDH释放量显著增加,A降低,证实缺氧/复氧造成HUVECs损伤。本研究观察了MDA,NO及SOD水平,结果显示缺氧/复氧引起细胞MDA和NO含量升高(P<0.05),SOD活性下降(P<0.05),表明自由基大量产生与缺氧/复氧损伤有关。给予梓葛冻干粉后,LDH释放量,MDA和NO含量显著降低,细胞活力提高,SOD活性显著提高,提示梓葛冻干粉通过提高缺氧/复氧状态下HUVECs的SOD活性,进而减少缺氧/缺氧引起的氧自由基增多而起到保护作用。梓葛冻干粉对HUVECs的保护作用通过哪些信号途径尚不清楚。近年研究发现,缺血/再灌注损伤与细胞凋亡密切相关。除严重缺氧导致部分细胞坏死外,坏死灶周边细胞及慢性缺氧/复氧损伤细胞大部分是以凋亡方式死亡。Anuradha等发现抗氧化剂的保护作用是通过维护线粒体跨膜压、拮抗Caspase-3激活和上调Bcl-2实现的。相关研究表明,葛根素能通过降低Caspase-3蛋白的表达水平,增强Bcl-2蛋白表达水平,上调细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax等,实现对缺血性脑损伤的神经保护作用。本研究观察了梓葛冻干粉对缺氧/复氧损伤HUVECs凋亡相关蛋白表达的影响,药物干预后,梓葛冻干粉显著提高缺氧/复氧组Bcl-2蛋白的表达,降低Bax和Caspase-3蛋白的表达,并上调Bcl-2/Bax,表明梓葛冻干粉可能通过增强细胞抗凋亡能力,从而