人脂肪间充质干细胞致瘤性实验研究

人脂肪间充质干细胞致瘤性实验研究

脂肪间充质干细胞是从脂肪组织中分离出来的具有干燥特征的细胞。由于它不仅具有很强的外展性和多向分析性能力，而且来源充分，易于分离和培育。它很快成为继骨髓间充质干细胞之后的研究热点。不论在组织工程还是基因治疗方面都具有广阔的应用前景。本文旨在通过体内和体外实验研究人脂肪间充质干细胞是否具有致瘤性,以确保其临床使用的安全性。1材料和方法1.1实验材料1.2动物分组、药物培养基和检测1.2.1裸鼠体内致瘤性实验动物按照体质量随机分为空白对照组、阳性对照组和脂肪间充质干细胞组,每组雌雄各16只。脂肪间充质干细胞组每只注射1×107个hMSC-AT,阳性对照组每只注射2×106个Hela细胞,空白对照组注射同批次生理盐水,3组均为每只0.2mL,于动物右前肢肋部皮下注射。分别于注射后3d、1个月、3个月、6个月颈椎脱臼处死动物后,对注射部位进行大体解剖观察和病理组织学检查,观察肿瘤形成情况,每次雌雄各解剖4只动物。1.2.2软琼脂克隆形成实验在6孔细胞培养板制备0.5%底层琼脂,室温凝固后,置2℃~8℃保存备用。在使用前,将培养板置于37℃培养箱中平衡。取对数生长期细胞制备成单细胞悬液,按不同密度配成0.35%上层琼脂。脂肪间充质干细胞终浓度分别为15000、7500、3000、1500、750、150个/孔。同时设立阳性对照孔(Hela细胞,5000个/孔)和空白对照孔。待培养基在室温凝固后,置37℃,5%CO2培养箱中培养21d。培养结束后,每孔中加入0.5mL0.2%结晶紫,染色至少1h后,显微镜下观察,计数大于10个细胞的集落数,并计算细胞集落克隆率,细胞集落克隆率=(平均细胞集落数/每孔中加入的细胞数)×100%。2结果2.1裸鼠体内肿瘤实验2.1.1动物注射部位病理组织学检查空白对照组注射后各时间点注射部位未见任何异常。阳性对照组注射后3d,部分动物注射部位有小结节生长;注射后1个月,阳性对照组动物注射部位均有大小不一的瘤体生长;注射后3个月和6个月时部分瘤体已经溃烂。脂肪间充质干细胞组注射后3d,有部分动物注射部位有小结节生长,此后结节逐渐消失,至注射后6个月,该组动物注射部位均未见有瘤体生长,见图1。2.1.2病理组织学检查空白对照组注射后3d~6个月,注射部位病理组织学检查均未见异常。阳性对照组在注射后3d,皮下组织或真皮内可见病灶结节,灶内细胞分裂象多见;注射后1个月,灶内细胞巢状排列,细胞分裂象多见;注射后3个月,灶内细胞巢状和(或)腺样排列,细胞分裂象多见;注射后6个月,灶内大部分细胞变性、坏死、钙化,残存的巢状排列的细胞可见细胞分裂象。脂肪间充质干细胞组在注射后3d,真皮和(或)皮下组织内可见疏松排列的梭形细胞团;注射后1~6个月,注射部位病理组织学检查未见异常,见图2。2.2实验2.2.1肉眼和显微镜观察的结果阳性对照组在培养至17d时,肉眼及镜下均可见有明显的集落形成;而脂肪间充质干细胞组及空白对照组至培养结束均未见有集落形成。2.2.2肿瘤检测结果培养21d后,阳性对照组的克隆形成率为2.7%,空白对照组和脂肪间充质干细胞组中均未见有集落形成。3脂肪间充质干细胞的致瘤性脂肪间充质干细胞不仅来源丰富、取材方便,而且同骨髓间充质干细胞有着相似的生物学特性,可作为组织工程的种子细胞来源,具有广阔的基础研究及临床应用前景,为今后的细胞治疗、基因治疗提供新视野。但有越来越多的研究表明,间充质干细胞与肿瘤的形成与发展密切相关,这使得间充质干细胞在临床应用中的安全性仍有待进一步研究证实。目前对于骨髓间充质干细胞的研究表明,长时间体外培养,间充质干细胞能发生恶性转化。Yamaoka等从24名志愿者的骨髓中分离提取间充质干细胞,并加入成纤维细胞生长因子2,培养出永生化的细胞系,移植入裸鼠体内后可以形成肿瘤,组织学检查发现其中包含不同分化的脂肪和软骨细胞。但Ra等在BALB/c裸鼠皮下注射传代3代的脂肪间充质干细胞,剂量为2.0×108个细胞/kg,观察26周后,未发现有致瘤性。本研究结果表明,在BALB/c裸鼠皮下接种人脂肪间充质干细胞后,前3d,部分动物在注射部位可以观察到由细胞团块形成的小结节,随后即被吸收,观察到6个月时,未见其有致瘤性,与Ra等研究的结果一致。表明脂肪间充质干细胞是否具有致瘤性,可能跟其传代次数有关。软琼脂细胞克隆形成实验是一种旨在模拟活体内细胞外基质的半固体生长环境,进行体外检测评估分析细胞纯系化集落生长潜力的常用实验方法。肿瘤细胞能无限增殖,表现出很强的克隆能力,而成熟分化的细胞则不能形成集落。本次实验中,人脂肪间充质干细胞在软琼脂介质中无形成集落的能力,不具备致瘤性。综上所述,人源脂肪间充质干细胞在短期传代后不具备致瘤性,有一定的安全性。其长期传代后是否具有致瘤性,还需进一步实验来研究。人脂肪间充质干细胞(humanmesenchymaliposetissuehMSC-AT,)由山东省红十字会介入医院提供(第5代),批号:20090723P5、20101112P5;Hela细胞由山西医科大学公共卫生学院提供;SPF级BALB/c裸鼠96只,雌雄各半,体质量16~19g,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心[生产许可证号:SCXK(军)2007-004,合格证号:0054