低产蛋白酶a啤酒酵母的诱变选育

低产蛋白酶a啤酒酵母的诱变选育

许多文献表明，酶a是影响纯生酒精泡沫稳定性的重要因素。降低纯生酒精中的酶含量，可以解决泡沫稳定性问题。尽管国内外啤酒研究者相继发表了大量关于从工艺措施降低蛋白酶A的研究报告,但是在啤酒酿造时,只有选用产蛋白酶A活性低的酵母菌株,才能从根本上解决纯生啤酒泡沫衰减问题。因此选育低产蛋白酶A菌种对于改善纯生啤酒泡沫性能至关重要。本试验采用甲基磺酸乙酯(EMS)对啤酒酵母进行化学诱变,最终得到低产蛋白酶A的优良菌株,遗传5代,测其发酵性能,表明遗传性状稳定。1材料和方法1.1培养基和荧光底物出发菌株:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),中国食品发酵工业研究院酿酒部;甘油培养基:2%甘油,1%蛋白胨,1%酵母浸粉,2%琼脂;甲基磺酸乙酯(EMS):Sigma;荧光底物(MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-leu-Lys(Dnp)-NH2):PeptideInstitute;牛血红蛋白:Sigma。1.2主要设备荧光分光光度计:F-4500,日立;气相色谱仪:AutoSystemXL,PerkinELmer;紫外-可见分光光度仪:岛津。1.3方法1.3.1细胞培养挑取麦汁斜面上保存的啤酒酵母一环,接入5mL麦汁培养液中,28℃培养24h。吸1mL培养的酵母液于无菌离心管中,3500r/min离心5min,收集细胞,无菌水同样条件离心洗涤2次。悬浮细胞于1mL无菌磷酸缓冲液(pH7.0)中,加40μLEMS原液,振荡分散细胞,分别置于30℃摇床培养20,30,40,50,60min;3500r/min离心5min,弃去上清液,5%Na2S2O31mL洗涤2次,再悬浮细胞于1mL无菌水中,然后稀释到10-3,取0.2mL稀释液涂布于YPD平板,28℃培养2～3d。1.3.2过滤方法(1)总糖酸变性染色蛋白2挑取上述诱变后YPD平板上生长的菌落,转移至甘油平板28℃培养3～4d,激活蛋白酶A,将10mL覆盖液(琼脂2%,0.3%酸变性血色蛋白)均匀倒于平板,37℃培养2～3d;然后在每个平板平铺10%三氯醋酸1～2mL,终止反应。根据透明圈直径与菌落直径比值的大小判断其水解酸变性血色蛋白的能力,比值越小说明蛋白酶A的活力越低。(2)发酵终止测定复筛采用三角瓶发酵法,挑取上述斜面低温保藏菌种一环;接入10mL麦汁培养液中,28℃培养24～48h;再将活化好的试管中菌液全部接入装有300mL无菌麦汁的三角瓶中,发酵栓密封,12℃发酵9d,记录每日失重量,当当日失重量在0.2g以内表明发酵结束。发酵结束后检测发酵液蛋白酶A活力、双乙酰还原能力(根据双乙酰含量反应酵母的双乙酰还原能力)和风味物质含量。1.3.3突变株的遗传稳定性试验挑取一环保存在麦汁斜面上的突变株转接至新的麦汁斜面,共传5代,对第5代突变株按照1.2.3(2)的试验方法进行三角瓶发酵试验,评价突变株的遗传稳定性。1.3.4分析定义器(1)死亡率致死率=100%−存活菌数活菌总数×100%=100%-存活菌数活菌总数×100%(2)荧光强度测定和样品预处理活力测定:采用荧光底物法。取1500μL磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液(pH5.3)于一玻璃试管中,加入1368μL去离子水,加入待测样品120μL,最后加入浓度为1mol/L荧光底物12μL。试样混合均匀,放入30℃水浴锅中,反应30min后,再放入80℃灭活5min,快速冷却到室温,用荧光分光光度计测量荧光强度,激发波长λex=328nm,发射波长λem=393nm。样品除气(成品啤酒)或双层滤纸过滤(发酵液),空白样品用去离子水代替样品。蛋白酶A活力降低率的计算:①出发菌株酶活的相对值=出发菌株的酶活力值-空白酶活力值;②突变株酶活的相对值=突变株的酶活力值-空白酶活力值;突变株酶活的降低率=出发菌株酶活的相对值−突变株酶活的相对值出发菌株酶活的相对值×100%突变株酶活的降低率=出发菌株酶活的相对值-突变株酶活的相对值出发菌株酶活的相对值×100%本试验所测蛋白酶A活力以荧光值表示。(3)发酵力以每天的CO2失重量计算出总失重量来衡量发酵力。(4)标准曲线的绘制顶空气相色谱法.将5mL发酵液装入20mL顶空瓶中,盖上胶塞,用铝制瓶塞密封,自动进样。结果分析用试样的峰面积与内标峰面积的比值(或峰高比值),查工作曲线,或使用回归方程计算出试样中各物质含量。色谱柱与色谱条件:毛细柱:PEG2M0.25mm×30m(SGE);固定相:Chrornosorbl03,60～80目;柱温:50℃;气化室和检测器温度:240℃;载气(高纯氮)流量:40mL/min;氢气流量:30mL/min;空气流量:400mL/min;顶空进样量:1mL。2结果与分析2.1双致死率结果根据1.3.1试验方法分别用EMS处理酵母悬浮液20,30,40,50,60min,所得致死率结果如图1所示。一般认为致死率在70%～80%左右获得正突变菌株的机率最高。由图1可得,EMS处理30min时的致死率在70%～80%范围内,因此确定EMS最佳诱变条件为:在磷酸缓冲液(pH7.0)条件下,浓度40μL/mL、处理时间30min。2.2选拔结果2.2.1复筛酵母菌生长结果如图2所示,从酸变性血红蛋白平板上生长的40株酵母菌株中,挑选出10株透明圈直径与菌落直径比值小于出发菌株的突变株,进行复筛。2.2.2突变株与出发菌株的荧光值比较对10株初筛突变株进行三角瓶发酵试验,测定发酵液中蛋白酶A活力,结果如表1所示。由表1可得,突变菌株E07、E09、E10、E25和E30的荧光值低于出发菌株,蛋白酶A活力与出发菌株X相比,低于出发菌株。所以选用这5株突变菌株再次进行三角瓶发酵验证试验。2.3三角瓶发酵试验2.3.1突变菌株的确定发酵力是酵母菌株发酵能力的重要衡量指标,快速有效的发酵才能适用于大批量的啤酒生产。对5株产蛋白酶A低的突变菌株进行三角瓶发酵验证试验。测定其发酵力,结果如图3所示。由图3可得,与出发菌种相比较,突变株E10发酵能力高于出发菌株,E25降糖速度较慢,其发酵力较差,其它突变株降糖与出发菌株基本一致。2.3.2e06、e5添加量、e基层对菌株降糖能力的影响发酵液双乙酰含量及主要风味物质测定结果如表2所示。由表2可得,突变株E07双乙酰含量低于出发菌株,表明其双乙酰还原能力强于出发菌株。突变株E25异戊醇含量远低于出发菌株,原因可能是其降糖能力差所致。其它菌株各风味物质含量与出发菌株基本一致。2.3.3其他突变株酶活测定结果如表3所示。由表3可得,突变菌株E10的蛋白酶A活力降低21.92%,其余突变株酶活降低不显著或出现升高现象。综上,通过对突变株发酵能力等各方面综合能力的评价可知,突变菌株E10发酵力较强,双乙酰还原能力表现正常,风味指标与出发菌株相比基本一致,并且蛋白酶A活力降低显著,选其为目的菌株进行遗传稳定性试验。2.4出发菌株与出发菌株的筛选结果如表4所示。由表4可见,第5代突变株E10蛋白酶A活力显著低于出发菌株,降糖能力和双乙酰还原能力与出发菌株相比基本一致,风味指标与出发菌株相比表现出酯高醇低的趋势,在保持出发菌株优良性状的同