2023年CB945100血管发育和稳态维持的遗传及表观遗传机制

工程名称：血管发育和稳态维持的遗传及表观遗传机制

2023.12023.8总后勤部卫生部一、关键科学问题及争论内容关键科学问题脊椎动物的血管发生和血管形成是一个高度保守的涉及多种细胞特化和定管发生和血管形成渐渐发育成具有精细简单等级构造的功能性血管网络并保持注的关键科学问题。具体包括：1、血管发生的遗传和表观遗传机制：血管系统形态建成的分子机制；表观遗传修饰的转变〔重点关注组蛋白的甲基化修饰以及基因组的甲基化修饰〕是否可以在血管形成过程中起到调整作用。2、血管内皮细胞特化和定向分化的分子根底：原始造血系统中成血管母细胞分化成血细胞和血管内皮细胞的谱系关系及其分子机理；定向造血系统中主动脉腹侧内皮细胞如何维持其细胞特异性或转化为造血干细胞的分子机理；冠脉内皮细胞特化的分子机制。3、重要信号通路影响血管重塑的遗传和表观遗传机制：TGF-和VEGF信号通路及其调控的miRNA-血管重塑和稳态维持的功能和机制。4、血管损伤后重塑的分子机制：血管损伤及重塑过程中凋亡平滑肌细胞的炎症放大作用及其机制；牵拉刺激引起内皮细胞炎症分子的释放；血管损伤及重塑过程中血管平滑肌细胞增生的分子机制和干预措施。主要争论内容1、血管发生是血管发育的早期大事，涉及图式形成、内皮细胞命运打算和分化等发育生物学和细胞生物学根本科学问题。本工程拟利用斑马鱼作为模式生物，通过大规模诱变技术筛选血管发生特别的突变体，查找血管及相关组织器官发育的重要调控因子与标记基因，进而深入争论它们在血管发生过程中的功能。在血管发生的表观遗传学机制方面，通过表达谱测序来得到斑马鱼中特定时期可能存在的甲基化酶或去甲基化酶，克隆得到这些基因，通过体mRNA建表达甲基化酶或者去甲基化酶的转基因鱼，结合体外生化试验验证这些甲基化酶或者去甲基化酶在血管形成不同时期的生理功能。此外，通过转基因方法在血管内皮细胞中特异性表达绿色或红色荧光蛋白〔GFPRF合长时间在体双光子或共聚焦显微镜成像技术，实时记录和跟踪中脑内的全部血管的三维形态变化。进而，运用图像分析、流体力学模型分析、细胞生物学、分子生物学等手段，争论脑血管网络发生和发育的宏观规律和分子机制。2、探讨血管内皮细胞特化和定向分化的分子根底。利用多种特异性标记血管系统的转基因鱼和大规模诱变技术筛选影响血管发生和造血系统的突变体，通过共聚焦显微镜进展实时观看并比较野生型与突变体中血管发生和造血过程的差异，争论血液血管母细胞分化成血管内皮细胞和血细胞的谱系关系及其调控网络。同时，结合内皮细胞特异性基因敲除技术，争论主动脉腹侧内皮细胞定向分化为造血干细胞的分子调控机理。此外，查找高等哺乳动物小鼠的冠脉内皮细胞起源，利用Cre-LoxP技术提醒Notch信号通路调控冠脉发生以及内皮细胞生物学活性的分子机制，说明心外膜促进冠脉发生的重要生理功能和机制。3、在重要信号通路影响血管重塑的遗传和表观遗传机制争论方面，主要利用基于Cre-LoxP系统的小鼠组织特异性条件基因敲除技术，构建血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、脑血管内皮细胞特异性基因敲除小鼠，深入争论不同类型TGF-VEGF及这种反响性特别如何导致血管重塑特别以及心血管疾病的发生。同时筛选TGF-调控的miRNAmiRNA-壁细胞相互作用、及其在血管重塑过程中的功能和机制进展深入的探讨。4、综合利用基因敲除小鼠和多种血管损伤模型，深入争论血管损伤后重塑的分IGF-1R-SGK1的作用、争论介导血管损伤后凋亡平滑肌细胞的炎症放大作用的关键分子机制、说明血管损伤及重构过程中炎症细胞的来源、说明阻断COX-2来源的前列腺素对血管损伤后内膜增生的保护作用及其分子机制。同时明确深海EPA/DHACOXEPA能否调整动脉损伤后血管重塑、以及深海鱼油EPA与阿斯匹林协同调整血管损伤后重塑以及抗血栓作用和机制。二、预期目标总体目标：开展血管发生和血管形成的遗传和表观遗传机制争论。本工程的总体目标如下：化和定向分化的调控机制；明确重要信号通路及其调控因子包括miRNA调整血管重塑稳态维持的功能和机制；探究血管损伤后重塑的分子机制及其干预措施。争论团队。五年预期目标：1、觉察一批的调控血管发生和血管形成的基因、组蛋白修饰因子或miRNA，说明这些调控因子影响血管发育的生理功能和分子机制；研制一批模拟人类心血管疾病的型遗传修饰动物模型；筛选鉴定一批具有潜在临床应用价值的心血管疾病诊断及治疗的的分子靶标。2、建立一整套血管发生和血管形成争论的技术平台和技术体系。3、培育一批中青年学术带头人和学术骨干；培育争论生〔含硕、博50博士后12名以上。4、在国际一流杂志〔IF>10〕发表论文8篇以上，在有影响力的杂志〔IF>5〕上发表论文20篇以上。三、争论方案总体争论思路和工程争论的技术路线及可行性侧重，又严密连接。课题组间通过合作相互促进。课题一：血管发生和调控的分子机制选到的转基因库入手，通过FACS分选结合一代测序技术得到血管及相关组织趣的基因，特别是编码甲基化酶、去甲基化酶的基因。随后，综合运用多种手段mRNA或morpholino〔MO〕Hsp、Gal4/UAS等系统的时空特异性转基因鱼系以稳定转变基因的表达，或者通过人工锌指核酸酶〔ZFN〕介导的基因打靶获得突变体，同时从已有的突变体库中遴〔通过整体胚胎原位杂交〕检测血管的发育与分子调控机制供给必要的理论与试验根底。在血管网络的形态发生方GFP或RFP过程。同时，结合图像分析、流体力学模型分析，并应用细胞生物学与分子生物总体争论方案如下：课题二：血管内皮细胞特化和分化的调控机制本课题将利用转基因斑马鱼遗传学和胚胎发育的优势以及本课题组筛选到统的转基因斑马鱼sclα-DsRed和sclβ-GFP，通过共聚焦显微镜进展实时观看〔liveimage〕并比较野生型与突变体中造血及血管生成过程的差异，从而说明sclscl基因敲低的Scl的分子机制。主要通过Cre-LoxP系统的组织特异性条件基因敲除技术，构建冠脉内皮特异性Cre小鼠，同时利用体内组织特异性转录因子标记技术和免疫共ChIP-SeqNotchHIF转录因子在调控冠脉内皮细胞的增值和分化过程中的分子机制。总体方案如下：课题三：血管内皮细胞及其微环境在血管重塑中的作用和机制系统的组织特异性条件基因敲除技术，研制血以及VEGFR2 条件基因敲除小鼠，深入争论血管内皮细胞和平滑肌细胞如何对TGF-和VEGF信号做出准确反响并调整内皮分泌血管重塑以及脑血管重塑和稳定性的生理功能和机制利用高通量芯片酵母双杂交免疫共沉淀结合质谱型血管调控候选因子并深入争论这些候选因子对血管生成靶基因的选择性及表达的影响探究候选因子调控血管生成的分子机制此外利认真血管特异性条件基因敲除小鼠筛选受TGF-信号调整的miRNA，并深入争论这些miRNA调整血管内皮细胞或者血管平滑肌细胞功能和稳态维持的作用和机制总体争论方案如下：课题四：血管损伤以及重塑的分子机制血管平滑肌细胞腔内迁移与增生导致官腔变窄是血管成形术和自体血管移滑肌细胞凋亡的分子机制〔IGF-1R-SGK1信号转导通路；进一步利用基〔如巨噬细胞激活作用〕,结合特别转基因工具小鼠的静脉移植模型争论静脉移植过程中〔内皮细胞剥脱〕为争论模型〔仿照动脉成形术，以转基因动物为争论工具，围绕膜磷脂代谢通路，〔如前列腺素或深海鱼油代谢产物对动脉损伤后血管重制剂总体争论方案如下：创点和稳态维持的分子机制。2、综合利用遗传修饰斑马鱼和小鼠的优势，实行正向遗传学和反向遗传学策略通路在血管重塑和稳态维持中的机制，可能觉察血管发生和发育调控的的机制。3、建立和完善血管发育争论的的争论方法和技术体系。4、实现在血管发生、血管形成及其稳态维持争论方面的理论创。5、建立型人类心血管疾病的遗传修饰动物模型，为心脑血管疾病的预防和治疗供给靶标。课题设置课题1、血管发生和调控的分子机制主要争论内容：以斑马鱼为主要的争论模式，充分利用本课题独有的转基因与突变鱼系资源，综合应用morpholinoknockdown、人工锌指核酸酶介导的基因定点突变等各种遗传学手段，结合整体胚胎原位杂交、FACS分选以及深度测序等各种分子基化酶，通过注射mRNA、构建多种形式的转基因鱼〔例如时空或组织特异性表达甲基化酶或去甲基化酶或其突变形式在血管形成的不同时期人为转变整个胚胎中的组蛋白或DNA的甲基化水平，检测这些基因对血管发生的作用。通过转基因方法在血管内皮细胞中特异性表达绿色或红色荧光蛋白〔GFP或RFP，分子生物学等手段，争论脑血管网络发育的宏观规律和分子机制。预期目标：形态发生以及基因表达调控网络提醒脊椎动物血管系统发生和调控的遗传与表肿瘤的预防、诊断与治疗、再生医学等应用供给坚实的理论根底。担当单位：北京大学、中国科学院上海生命科学争论院、清华大学课题负责人：张博学术骨干：杜久林、贾顺姬、于蓬春经费比例：28.8%课题二：血管内皮细胞特化和分化的调控机制主要争论内容：DsRed或GFPscl-αscl-βscl转基因斑马鱼。从单细胞水平观看表达任何一scl亚型的细胞动态行为以及其它们与其他因子的相互关系和相互作用。利用我们首创条件性〔可诱导性〕scl基因敲除斑马鱼品系，它可以在期望的细胞群scl亚型失活或恢复。加上利用斑马鱼大规模正向遗传学66scl基因scl在淋巴管形成中的作用以及它与其它淋巴管形成调整因子的相互作用。Cre-LoxP系析，构建体内组织特异性转录因子标记技术平台，探究与Notch信号通路相互作用的型血管调控因子和下游调控血管内皮细胞生物学特性的靶基因。预期目标：说明斑马鱼原始造血系统中成血管母细胞分化成血细胞和血管内皮细胞的脉内皮细胞起源，利用Cre-LoxP技术争论Notch信号通路如何调控冠脉发生，提醒Notch调控内皮细胞生物学活性的机制，说明心外膜促进冠脉发生的重要心肌病供给的治疗靶点。担当单位：中国科学院上海生命科学争论院、南方医科大学课题负责人：周斌学术骨干：温子龙、张文清、张跃波、廖旺军、廖禹林经费比例：19.4%课题三：血管内皮细胞及其微环境在血管重塑中的作用和机制主要争论内容：利用基于Cre-LoxP系统的组织特异性基因表达或基因敲除技术，通过系统的动物整体和组织学表型分析、体外细胞功能检测和体外生化试验深入争论TGF-和VEGF信号在生理性血管重塑或者损伤后内皮分泌炎症分子以及血管重技术筛选与TGF-、雌激素和HIF-1信号通路相互作用的型血管形成调控候选因子以及受TGF-信号通路调整的miRNA/RT-PC〔ChIPChIP-seqWesternblot等方法检测这些候选因子和miRNA对血管生成靶基因的选择性及表达的影响，包括对血管生成相关的重要调整因子如血管内皮细胞生长因子〔VEGF〕等表达的影响，探究候选因子和miRNA调控血管形成的分子机制；在体外细胞水平和体内小鼠模型中检测候选因子和miRNA对血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成的影响。预期目标：说明TGF-和VEGF信号调整内皮细胞及其微环境的遗传和表观遗传机制及其调控血管重塑和稳态维持的生理功能和机制。觉察一批的与TGF-、VEGF和雌激素信号通路相互作用的型血管形成调控候选因子以及受TGF-信号通路调整的miRNA，说明这些型调控因子在血管形成中的功能，为相关心血管疾病争论供给的试验模型和候选治疗靶标。担当单位：军事医学科学院、北京大学课题负责人：杨晓学术骨干：叶棋浓、罗金才、兰雨、王剑、姜怡经费比例：32.4%课题四：血管损伤以及重塑的分子机制主要争论内容：由血管内膜高度增生为特征的血管重塑导致血管堵塞性疾病的主要缘由如别争论其内在机制及其可能干预效果。静脉移植后重塑机制：将围绕IGF-1R-SGK1信号通路，利用机械拉力装置、三维培育模型体外模型和IGF-1RSGK1基因敲除小鼠静脉移植模米胶3维共培育模型，争论凋亡平滑肌细胞的去除机制及炎症放大作用。最终利用CX3CR1-GFP转基因小鼠的静脉移植模型，结合传统的分子生物学方法说明制。动脉机械损伤后重塑：将瞄准血管急性炎症分子COX-2及其脂质代谢通路的关键酶与受体，利用小鼠的动脉内皮损伤模型，查找COX代谢的关键前列腺素、受体、介导血管平滑肌细胞迁移、增生的信号转导通路；同时，深海鱼油〔EPA/DHA〕也通过COXCOX〔Resolvin产物〕。预期目标：血管内膜增生、管腔变窄是支架植入以及静脉移植搭桥失败的主要病理特如前列腺素参与了这一病理过程。本课题总的目标：1〕利用静脉移植模型，验源。2〕利用动脉损伤模型，明确炎症因子诱导表达基因COX-2在血管损伤后EPA在抗血管重塑论依据。担当单位：中国科学院上海生命科学争论院、首都医科大学附属北京安贞医院课题负责人：余鹰学术骨干：杜杰、申毓军、顾云经费比例：19.4%各课题间相互关系需求，设置四个子课题，总体状况如下：观遗传调控机制。四、年度打算争论内容 预期目标1、利用遗传修饰斑马鱼模型分析血管发育相关候选基因及表观遗传修饰调整蛋白的时空表达谱。2、建立脑血管三维网络定量分析方法。争论脑血管三维网络发育的规律。3、争论scl-β的表达和主动脉内皮第细胞形成造血干细胞过程的相互关系。4、研制一系列在特定心血管系统细—胞特异性转基因或条件基因敲除小鼠。5、筛选受血管发育重要信号通路调年节或相互作用的型调控分子或miRNA。6、利用小鼠静脉移植模型和股动脉用。

1、筛选得到一系列与斑马鱼血管生成相关的候选基因以及表观遗传修饰蛋白。2、初步提醒脑血管网络发育的宏观规律。3、初步说明斑马鱼争论其原始造血系统中成血管母细胞分化成血细胞和血管内皮细胞的谱系关系及其分子机理。4、获得一系列表达或敲除效率明确的特定心血管细胞类型特异性转基因或条件基因敲除小鼠。5、获得型血管调控候选因子以及在不同类型心血管细胞中受重要信miRNA。6、建立完善小鼠静脉移植模型、股的作用。7、发表SCI3-4篇。培育8-10名。争论内容 预期目标1、遴选感兴趣的基因，利用基于ZFN或其它方法的基因定点突变技2、争论血管生和血管修剪在脑血基于G-CaMP的脑血管内皮细胞钙成像技术。3、争论scl-β的表达和主动脉内皮细胞形成造血干细胞过程的相互关系。第4、连续研制型在特定心血管系统变小鼠进展系统的动物整体和组织二学表型分析。5，利用各种蛋白质间相互作用技术验证型候选因子与相关信号通路年中核心蛋白的相互作用。6，利用体外细胞模型，检测候选基因或miRNA对心血管系统细胞增殖、迁移、血管生成、内皮细胞-周细胞相互作用等功能的影响。7、建立机械牵张力刺激下的三维细胞培育模型争论候选基因对静脉移形成、炎性细胞浸润、巨噬细胞表型分化的作用。 争论COX下游的前列腺素产物的相应受体在动脉损伤后重塑的作用及其分子机制。

1、初步建立血管及相关组织器官的全基因组时空表达谱。制备3个候2-3个的血管生成相关候选基因的功能。2、提醒脑血管三维网络形成的细胞生物学机制。3、明确斑马鱼定向造血系统中主动脉腹侧内皮细胞如何维持其细胞特异性或转化为造血干细胞的分子机理。4，明确构建的型心血管细胞特异性条件基因敲除小鼠的血管相关表型。5，证明型血管调控候选因子与相关信号通路中核心蛋白存在相互作用。6，明确候选基因或miRNA对心血管系统细胞体外功能的影响。7IGF-1R、AMPK在机械牵张力引起的静脉平滑肌细胞凋亡中CARD9cathepsinS、CD73在静脉移植后血管重构中的E受体在动脉损伤后重塑的作用和可能介导信号转导通路。8、发表SCI5-6篇。培育8-10名。争论内容 预期目标1、选择具有血管及相关组织器官发的来源和它们进入脑部后的迁移方式。争论Ca2+在血管内皮细胞迁移中的作用。3、争论参与EHT过程转录因子如scl-β、runx1c-myb之间的分子机制框架。4、争论胚胎发育过程中冠脉内皮细第型鉴定。三5、体外争论重要信号通路分子在不同类型心血管细胞缺失以及过表达年分泌、胞外基质合成等功能的影响。蛋白对血管生成靶基因的选择性及表达的影响。7、TGF-βmiRNA靶分子的鉴定和验证。静脉中细胞凋亡的作用及静脉移植后生内膜形成的转变。观看EPA/DHA对血管损伤后重塑的影EPA/DHA是否同COX子机制。

6个个的血管生成相关候选基因的功能。进入脑部的途径。3scl-β在造血干细胞从血源性内皮起始的过程。血管形成缺陷。5、明确TGF-β、VEGF信号通路特定分子对不同类型心血管细胞体外功能的影响。基因的选择性及表达的影响。7TGF-β信号通路调整miRNA在心血管系统细胞中的靶分子。8、验证IGF-1R、AMPK通过调整静脉平滑肌细胞凋亡调控静脉移植中CARD9、CD73的激活；验证巨噬细胞活化后cathepsinS对于静脉平滑肌的调控作用。了解EPA/DHA机制。9、发表SCI6-7篇。培育10-12名。争论内容 预期目标管及相关组织器官发育缺陷的突变体，深入分析表型与作用机制。制。以及Ca2+在血管生长和修剪中的作用。3、连续争论参与EHT过程转录因scl-β、runx1c-myb之间的分子机制框架。第4、通过芯片比对结合体外生化试验〔TGF-β信号、VEGF信号、Notch信号等〕在不同类型心血管细胞的靶基因。四5、确定与重要信号通路相互作用的年6、心血管系统组织特异性过表达miRNA转基因小鼠的研制。起的静脉平滑肌细胞凋亡的分子机EPA/DHA或可可油在血管损伤后的血管重塑有无协同作用和可能机制。

110个斑马鱼基因突变3个以上关键基因对于斑控机制。3、明确scl-β与其他转录因子如runx1c-myb的相互作用的调控通路及其分子机制。4、提醒重要信号通路分子〔TGF-β信号、VEGF信号、Notch信号等〕调控内皮细胞特化和分化中重要的分子机制。5、说明与重要信号通路相互作用的miRNA转基因小鼠。7、说明IGF-1R、AMPK调控机