酸败成品黄酒中乳酸杆菌培养及菌种初步鉴定

酸败成品黄酒中乳酸杆菌培养及菌种初步鉴定

黄酒是以糯米、大米、小米、小米、玉米、小麦等为原料的。通过浸泡和蒸发，我们可以通过各种酶、细菌、细菌（菌株、黄酒乳酸杆菌）和其他药物参与。黄酒（绍兴酒、半甜黄酒、半干黄酒和黄酒）的发酵过程是糖和母液的三种代谢过程。同时，通过混合和发酵，将酒精转化为混合和分解，将细菌（植物作用：黄酒、乳酸菌）转化为具有相同反应效果的三个部分：混合和发酵。甜黄酒（洋酒）主要是由细菌（浙江省）发酵引起的，但细菌（浙江省）的作用很少。这是细菌（浙江省）的主要发酵过程。在黄酒的发酵过程中，有许多类型和密度的细菌（菌株、黄酒乳酸杆菌）和菌株。近几年研究报道:从黄酒酿造中分离鉴定出的乳酸杆菌有戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosusstrain)、棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformissubsp.Torquens)、希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus.plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus.brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus.casei)、Lactobacillus.harbinensis、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)等等,在这些分离鉴定出的乳酸杆菌中,以植物乳酸杆菌为最多,因为植物乳酸杆菌的来源最广,在黄酒酿造中作用较大。但黄酒酿造过程微生物种类特别多,有许多新的种及优势菌种,如黄酒发酵结束酒精度达17.0%vol以上,最高可达22.0%vol,成品黄酒酒精度在17%vol~20%vol,引起坛装或大罐贮存黄酒酸败的主要菌种,不能在现有报道的培养基(MRS培养基、改良MRS培养基、麦芽汁培养基、米曲汁培养基、加碳酸钙培养基、营养琼脂培养基等等)中生长,因此无法检测出。为检测出这些引起坛装或大罐贮存黄酒酸败的乳酸杆菌,试验研究出了新的检测和培养方法,报告如下。1材料和方法1.1加所需培养的培养基坛装绍兴加饭酒、淋饭酒母、速酿酒母、传统加饭酒发酵醪、机制加饭酒发酵醪、坛装酸酒(非漏坛、包装完好)取自公司生产车间和仓库,淋饭酒母、速酿酒母、传统加饭酒发酵醪、机制加饭酒发酵醪、坛装酸酒(非漏坛、包装完好)所用的取样瓶、取样过程需无菌操作。理化分析用试剂外购。MRS培养基、改良MRS培养基、麦芽汁培养基、米曲汁培养基、营养琼脂培养基、米曲汁碳酸钙培养基等等配培养基的试剂外购;“X”物质外购。坛装绍兴加饭酒必须符合《绍兴酒》GB/T17946-2008国家标准,淋饭酒母、速酿酒母、传统加饭酒发酵醪、机制加饭酒发酵醪为生产正常的批次。坛装酸酒(非漏坛、包装完好)为贮存一年或以下过程中酸败的酸酒。1.2仪器、设备和检测设备0.01g电子天平JH3102,上海精科天美科学仪器有限公司;生化培养箱SPX-250B,上海跃进医疗器械厂;霉菌培养箱MJX-250B-2,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;光学显微镜XSP-2C,上海尚光显微镜有限公司;多用皇冠盖压盖机,郑州玉祥包装机械有限公司;HHS型电热恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;101A-2电热鼓风恒温干燥箱,上海康路仪器设备有限公司;SW-CJ-1F洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;YN-ZD-10不锈钢电热蒸馏水器,上海博迅实业有限公司;无菌室,自制,在无菌室内放洁净工作台,提高无菌程度;岛津气相色谱仪GC-14系统(柱温:70℃,汽化、检测:200℃,进样量:0.5μmL)、AT.LZP-930(18×0.53)白酒分析专用柱,日本岛津公司;500mL、200mL压口盖玻璃酒瓶,分析用仪器等。2方法3结果与分析3.1结果3.2分析4结论和讨论4.1培养基配方的确定2.1MRS培养基的配制、改良MRS培养基的配制、麦芽汁培养基的配制、米曲汁培养基的配制、营养琼脂培养基的配制、米曲汁碳酸钙培养基的配制。2.2样品处理:淋饭酒母、速酿酒母、传统加饭酒发酵醪、机制加饭酒发酵醪取样后在无菌室用一层经灭菌过的纱布过滤后,接入。坛装酸酒在无菌室直接接入。2.3无菌水试管:10mL蒸馏水试管在高压灭菌锅0.1Mpa灭菌30min,放入无菌室备用。2.4培养基的配制:取坛装加饭酒,测定酒精度,而后加水稀释至酒精度17.0%vol,加入总培养液量0.1%、0.3%、0.5%的“X”物质,加可溶性淀粉0.3%、0.5%、0.7%,充分搅匀溶解,200mL玻璃瓶分别装10mL培养液,压盖密封,于85℃水浴锅维持40min灭菌,冷却后于18℃空白培养3d,而后于30℃空白培养2d,再在85℃水浴锅维持40min灭菌,放无菌室备用。“X”物质的不同加量、可溶性淀粉的不同加量、培养温度18℃、25℃、30℃进行三因素三水平正交试验如表1、表2。在无菌室把经一层纱布过滤的发酵醪直接接入,压盖密封进行培养,每天观察细菌生长情况,与常规培养基对照,并详细记录。选择出适宜的培养基配方和培养方法。原酒培养基(加饭酒培养基):取坛装加饭酒,测定酒精度,而后加水稀释至酒精度17.0%vol或不稀释,灌入玻璃酒瓶,压盖密封,按上述方法进行灭菌,即为原酒培养基(加饭酒培养基)。2.3测定:通过正交试验选择出的培养基配方,配制培养液,于200mL玻璃瓶每瓶分别灌10mL培养液,压盖密封;不加可溶性淀粉和“X”物质配制成培养液,在500mL玻璃瓶每瓶分别灌300mL培养液,压盖密封;上述培养液于85℃水浴锅维持40min灭菌,冷却后于18℃空白培养3d,而后于30℃空白培养2d,再在85℃水浴锅维持40min灭菌,放无菌室备用。样品接入300mL优选的培养基培养后测定酒精度、还原糖、总酸、挥发酸,空白样对照,样品接入10mL培养基观察生长速度。样品稀释后无菌接入上述优选的培养基中,压盖密封,分别在18℃和30℃培养,每天观察培养液混浊情况,培养液混浊,进行测定。测定酒精度、总酸(以乳酸计)、还原糖(以葡萄糖计)、挥发酸(以乙酸计)。酒精度测定按《黄酒GB/T13662-2008》,总酸(以乳酸计)、还原糖(以葡萄糖计)、挥发酸(以乙酸计)测定按参考文献,镜检,培养结束后观察乳酸杆菌的形态。仲丁醇、异丁醇、异戊醇、乳酸乙酯微量成份的测定是用培养液100mL加水100mL在蒸馏器上蒸馏出100mL蒸馏液,蒸馏液在气相色谱仪上的测定值。2.4初步鉴定:对照《伯杰细菌检定手册(第八版)》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行初步鉴定。3.1.1通过正交试验和以前的试验,黄酒发酵醪及酸败黄酒中高耐酒精度优势菌的培养基配方和培养方法为:加饭酒稀释至酒精度17.0%vol、加“X”物质的量0.3%、加可溶性淀粉0.5%或不加、培养温度18℃或30℃、压盖密封培养,其他配方组成生长不佳。酒药、酒母、生麦曲、浸米浆水、发酵醪等中酵母在上述优选的培养基中不生长,霉菌不生长。3.1.2不同样坛装酸酒(非漏坛、包装完好、为贮存一年或以下过程中酸败的酸酒)直接接入原酒培养基(酒精度分别为1#、2#为18.0%vol和3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#为17.1%vol)中在30℃和18℃分别培养,培养结束测定结果如表3。而浸米浆水、麦曲、酒药、荷叶直接入原酒培养基(酒精度17.1%vol),无菌生长。3.1.3在无菌室,酸酒直接接入优选的培养基中培养,18℃培养生长快。30℃培养,有部分酸酒中细菌能生长,培养结束测定结果如表4。而浸米浆水、麦曲、酒药、荷叶直接入原酒培养基(酒精度16.9%vol),无菌生长。3.1.4酸酒直接接入优选的培养基中培养后的培养液,在无菌室用无菌水稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8分别取1mL接入优选的培养基中进行培养,纯化。并进行性能测定。对照《伯杰细菌检定手册(第八版)》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行初步鉴定,初步鉴定为乳酸杆菌的新种,暂命名为黄酒乳酸杆菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ),有两类,大部分为18℃生长良好,25℃以上生长不良或生长极慢,但不会至其死亡,暂命名为黄酒乳酸杆菌Ⅲ-1(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-1);另一类为30℃生长良好,18℃以下生长缓慢或不生长,暂命名为黄酒乳酸杆菌Ⅲ-2(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-2)。3.1.5黄酒乳酸杆菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ)的性能:黄酒乳酸杆菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ)是引黄酒贮存过程中酸败的主要乳酸杆菌,不能在现有报道的培养基(MRS培养基、改良MRS培养基、麦芽汁培养基、米曲汁培养基等等)中生长,黄酒乳酸杆菌Ⅲ为厌氧或微需氧,不利用酒精,培养液中需酒精,乙醇能促进其生长,能耐酒精度17.0%voL左右,不耐22%voL的酒精,黄酒乳酸杆菌Ⅲ必需特定的维生素等微量成份,能液化淀粉和糊精,能分解蛋白质为多肽和氨基酸,产胞外多糖(即粘稠物质),产细菌素,能在低pH3.8左右生长,在pH4.0生长良好;83℃,10min能灭死黄酒乳酸杆菌Ⅲ。黄酒乳酸杆菌Ⅲ-1(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-1),18℃生长良好,25℃或以上生长不良或生长极慢,但不会至其死亡,是引起贮存黄酒酸败的主要乳酸杆菌,在合适的培养条件下,在成品黄酒中产酸10.0g/L以上,最高产酸达15.0g/L以上;培养后,总酸为19.4g/L的形态:单生、对生(——形连接、八字形连接),短链,以单生居多,直杆菌,不运动,大小:0.4~1.0×2.5~8.0μm为主。黄酒乳酸杆菌Ⅲ-2(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-2)为贮存黄酒中在较高温度中引起酸败的主要乳酸杆菌,30℃生长良好,20℃或以下生长缓慢,在成品黄酒中产酸10.0g/L以上,最高产酸达15.0g/L以上,总酸达20.0g/L时的形态:单生、对生(——连接、八字形连接),对生少,八字形连接更少,短链、少量长链状,直杆菌,长链状无弯曲状,大小:0.1~0.5×3.5~10.0μm,少量更长杆菌,有弯曲状。3.2.1通过正交试验,优选出了分离、培养贮存过程中酸败黄酒乳酸杆菌的培养基。此培养基17.0%vol的酒精抑制酵母的生长,在优选的培养基中酵母不生长;17.0%vol的酒精、低pH4.0,及快速生长的乳酸杆菌能够抑制霉菌的生长,霉菌在此培养基中不生长;芽孢杆菌在17.0%vol不生长。因此,分离、筛选黄酒乳酸杆菌方便,同时可快速分离、筛选高耐酒精度的其他乳酸杆菌。原酒培养基(加饭酒培养基)也能培养部分贮存过程中酸败黄酒乳酸杆菌,但生长缓慢,耗时。而且有一些常规乳酸杆菌也能在成品黄酒中生长,而使成品黄酒酸败。3.2.2由于是压盖密封液体培养,因此黄酒乳酸杆菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ)的部分性能无法测定,而且是初步鉴定。3.2.3用优选的培养基在18℃、30℃培养酒药、麦曲、荷叶,无菌生长;可能是优选出的培养基没有达到黄酒发酵醪的状态,而使酒药、麦曲、荷叶中休眠状态的乳酸杆菌生长,需进行一步研究。浸米浆水中的乳酸杆菌不耐高酒精度,在优选培养和原酒培养基(加饭酒培养基)中不生长。3.2.4从表3和表4可知:酸黄酒中有异型乳酸杆菌存在,酸黄酒直接入优选出的培养基或原酒培养基,异型乳酸杆菌同时快速生长,在产酸的同时,产一定量的酒精,酒精度升高。异型乳酸杆菌能从精氨酸产氨,被酵母利用产微量的EC。在酒母和前发酵醪中只有少量黄酒乳酸杆菌Ⅲ-1或黄酒乳酸杆菌Ⅲ-2,但在后发酵醪及发酵结束中大量存在,黄酒乳酸杆菌Ⅲ的来源是酒药、麦曲、酒母、工器具、熟地。当酒精度升高,其生长、繁殖,数量大量增加。煎酒过程,酒、坛、荷叶等灭菌不彻底及不能灭死坛颈空气中乳酸杆菌,是引起贮存过程中黄酒酸败(非漏坛、包装完好、密封)的主要原因。4.1.1运用正交试验法,优选出贮存黄酒酸败的乳酸杆菌培养、分离的培养基配方和培养方法为:加饭酒稀释至酒精度17.0%vol、加“X”物质的量0.3%、加可溶性淀粉0.5%或不加、培养温度18℃或30℃、压盖密封培养。此培养基也可以培养和检测黄酒发酵醪、贮存酸败黄酒中的乳酸杆菌及黄酒煎酒、瓶装酒的灭菌效果。同时可快速分离、筛选高耐酒精度的其他乳酸杆菌。4.1.2引起贮存黄酒酸败的乳酸杆菌,在上述培养基中18℃生长良好,25℃以上生长不良或生长极慢,但不会至其死亡,在现有报道的培养基中不生长;这是以前从未报道过的乳酸杆菌,初步鉴定为乳酸杆菌的新种,是黄酒酿造中所特有的乳酸杆菌,命名为黄酒乳酸杆菌