高龄小鼠皮肤细胞衰老模型的构建

高龄小鼠皮肤细胞衰老模型的构建

皮肤是人体最表面、最大器官。随着年龄的增长,皮肤会逐渐老化、功能减弱或丧失,延缓皮肤衰老已成为人们关注的热点之一。以中草药天然成分为主的美容化妆产品因其不良反应少、安全性高而受到消费者的青睐。GX-50为花椒中的一种天然成分,其分子式为(E)-N-[2-(3,4-二甲氧基苯基)乙基]-3-苯基丙烯酰胺。本实验室前期研究发现,GX-50可以抑制转录因子NF-κB的活化;而阻断NF-κB的活化可以使衰老的皮肤年轻化。皮肤成纤维细胞是真皮的主要组成细胞,其分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质部分共同构成了真皮的主体。且皮肤成纤维细胞具有易体外分离培养、生长速度快、代谢旺盛等特点,故皮肤成纤维细胞在研究细胞水平的皮肤衰老中起着极其重要的作用。胶原蛋白对于保持皮肤光滑、避免皱纹产生有重要作用;丙二醛(malondialdehyde,MDA)是皮肤氧化损伤的主要产物之一,可以与脂蛋白、DNA等大分子发生交联,这些交联产物是皮肤色素和老年斑的主要前体;Severino等证实β-半乳糖苷酶是一种鉴别细胞衰老的标志酶,β-半乳糖苷酶染色实验可直观地鉴定皮肤细胞的衰老程度。在本研究中,我们采用了上述指标来探究GX-50抗皮肤衰老的作用。对高龄小鼠皮肤涂抹GX-50后进行组织学观察,并检测胶原蛋白含量的变化。以原代培养的人皮肤成纤维细胞为研究对象,对GX-50作用前后细胞β-半乳糖苷酶表达量、MDA分泌量及活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)含量的变化进行了检测。1材料和方法1.1材料表面1.1.1体质量,指数法见表2清洁级C57BL/6J雌性小鼠9只,20月龄;白色雌性家兔3只,体质量为2.0～2.5kg。所有动物均由上海斯莱克实验动物有限公司提供,动物生产许可证号码为SCXK(沪)2012-0002,使用许可证号码为SYXK(沪)2007-0025。1.1.2皮肤组织由上海瑞金集团闵行中心医院泌尿外科提供,取自包皮环切手术废弃组织,经患者本人同意。1.1.3试剂和试剂盒制备GX-50((E)-N-[2-(3,4-二甲氧基苯基)乙基]-3-苯基丙烯酰胺)购自Sigma公司,其他药品均为国产分析纯。母液制备:GX-50粉末溶于二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)中,终浓度为100μmol/L。实验时根据具体需要将母液用磷酸缓冲液(phosphatebuffer,PBS)稀释至相应浓度。MDA试剂盒购自南京建成生物制品公司;β-半乳糖苷酶染色、ROS检测试剂盒购自碧云天生物制品公司。1.2自然衰老大鼠皮肤老人的检测1.2.1免疫组织化学小鼠背部肩胛下脊柱两侧剃毛(面积均为2cm×2cm),左侧为实验侧,将GX-50(0.3mg/kg)与凡士林混合后涂抹局部皮肤;右侧为对照侧,将等量PBS与凡士林混合后涂抹局部皮肤。连续涂抹14d,第15天麻醉后处死动物。取处理过的皮肤,去皮下脂肪组织,制作冰冻切片,进行HE染色,光学显微镜下观察两侧皮肤组织的改变。采用Ⅰ型胶原蛋白抗体进行免疫组织化学染色,步骤如下:丙酮固定冰冻切片,4℃,10min;PBS充分洗涤后3%H2O2室温避光孵育10min,PBS充分洗涤;25%的鸡蛋蛋清孵育,室温,20min;5%的小牛血清孵育37℃,30min;含0.3%TritonX-100的PBS作用于切片,37℃,30min;按1∶200稀释Ⅰ型胶原蛋白一抗后作用于组织切片,4℃,12h,PBS充分洗涤;按1∶500稀释HRP标记的羊抗兔二抗后作用于组织切片,室温,2h;滴加DAB显色,37℃,30min;蒸馏水迅速冲3次后加入0.01mol/LPBS终止反应;乙醇进行梯度脱水;封片,光学显微镜下观察,蓝色颗粒的含量和分布情况即为Ⅰ型胶原蛋白的含量和分布情况。1.2.2小鼠组织蛋白的分离纯化收集上述不同处理组的小鼠皮肤组织,剪碎后加入组织裂解液并充分研磨,4℃、12000r/min离心15min,取上清获得组织蛋白样品。不同处理组的蛋白采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)进行分离,后电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转膜奶粉封闭后,孵育特异性一抗4℃过夜,孵育二抗1h后,采用化学发光法系统感光X胶片。1.3皮肤移植模型的检测指标1.3.1皮肤细胞衰老模型的建立原代培养人皮肤成纤维细胞,当细胞生长至80%～90%融合时传代。采用第10代生长良好细胞,分别按4×104个/孔接种于6孔培养板,培养24h后加药处理。共分为5组,其中空白对照组、DMSO组、GX-50组分别加入终浓度为100μmol/L的PBS、DMSO和GX-50,37℃孵育12h,PBS洗涤2次;H2O2组(皮肤细胞衰老模型):加入终浓度为50μmol/L的H2O2,37℃孵育30min,PBS洗涤2次,每隔2d作用1次,共作用4次;GX-50预处理后H2O2处理组(GX-50+H2O2组):先加入终浓度为100μmol/L的GX-50,37℃孵育12h,PBS洗涤2次,再加入终浓度为50μmol/L的H2O2,37℃孵育30min,PBS洗涤2遍,每隔2d作用1次,共作用4次。1.3.2糖苷酶染色测定收集上述处理过的细胞用于β-半乳糖苷酶染色实验,测定方法按照试剂盒说明书操作,实验重复3次。光学显微镜下观察β-半乳糖苷酶的表达情况。1.3.3月经期测定daa含量收集上述处理过的细胞培养上清测定MDA含量,测定方法按照试剂盒说明书操作,实验重复3次。1.3.4加药处理细胞培养同1.3.1,按1×104个/孔接种于96孔板,培养24h后加药处理,分组方法也同1.3.1。每组重复5个复孔,用于胞内ROS含量测定,测定方法按照试剂盒说明书操作,实验重复3次。1.4单次给药后家兔眼底反应情况给药前评价每只家兔的角膜、虹膜及结膜,均属正常。分别将0.1mL终浓度为100μmol/L的GX-50药液滴入家兔左眼结膜囊内,右眼滴入等体积的PBS作为对照。给药后家兔眼睛被动闭合8～10s,每天给药4次,连续7d,观察每次给药前眼部情况及最后一次给药后4、12、24、48、72h时点时角膜、虹膜和结膜的反应情况。给药期间,每天观察2次,取2次最高分即为当日分值,停药后继续观察3d的眼部反应情况。严格按照Draize眼刺激性试验的评分标准对GX-50的刺激性进行评分。末次观察后处死家兔,剪取双眼,肉眼观察有无红肿和水肿现象,取角膜用10%中性甲醛溶液固定,石蜡切片,HE染色,光学显微镜下观察。1.5统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学处理,计量数据以ˉx±sx¯±s表示,组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1gx-50对成熟大鼠皮肤的影响2.1.1皮肤组织的变化2.1.2皮肤组织中钙含量的变化2.2gx-50对皮肤纤维细胞的衰老的影响2.2.1苷酶染色结果空白对照组、DMSO组及GX-50组β-半乳糖苷酶表达量均很低,染色结果无明显差异。H2O2组β-半乳糖苷酶染色的阳性率很高,与之相对比,GX-50+H2O2组的阳性率明显降低(图4)。2.2.2mda荧光值检测取各处理组和空白对照组细胞培养上清,测定MDA含量,结果显示DMSO组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);GX-50组细胞MDA分泌量较空白组下降30.45%,GX-50+H2O2组较H2O2组下降61.46%,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。ROS荧光值测定结果显示,DMSO处理组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);GX-50组较空白对照组下降8.03%,,GX-50+H2O2组较H2O2组下降8.36%,两组比较差异也均有统计学意义(P<0.05)(表1)。2.3gx-50药对兔眼刺激性实验GX-50药液滴眼1周,每天给药前和最后一次给药后肉眼观察发现,家兔眼角膜无混浊,结膜无充血,虹膜正常,无水肿、坏死等异常现象,角膜、虹膜、结膜刺激性综合评分为0分,表明实验浓度的GX-50药液对兔眼无刺激性。组织学观察结果显示多次滴入GX-50药液的兔眼(左眼)角膜(图5)与未涂药眼(右眼)比较无差异,证明实验浓度的GX-50对兔眼无刺激性。3皮肤衰老的变化Westernblotting技术检测结果说明GX-50具有促进胶原蛋白表达的作用。β-半乳糖苷酶染色提示DMSO作为GX-50溶剂对于细胞衰老无明显影响,实验浓度的GX-50、DMSO均未引发细胞衰老,GX-50预处理皮肤成纤维细胞可以消减H2O2引发的细胞衰老。MDA和ROS检测结果说明DMSO作为GX-50溶剂对细胞MDA产生无明显影响,GX-50对于皮肤成纤维细胞氧化损伤产物MDA的分泌有明显抑制作用。ROS测定实验结果说明DMSO作为GX-50溶剂对于细胞ROS产生无明显影响,GX-50对于皮肤成纤维细胞ROS蓄积具有明显的抑制作用。真皮由成纤维细胞及其合成的胶原纤维、弹性纤维和细胞外基质组成,真皮成纤维细胞数的减少、合成胶原纤维和弹性纤维的能力下降及氧化损伤引发真皮结构的变化是皮肤衰老发生的主要原因。皮肤衰老主要表现为皮肤松弛、弹性下降、皱纹增多和产生老年斑等,抗皮肤衰老药物和化妆品的开发一般以抵御和延缓上述衰老现象发生为目标。本研究采用体内和体外实验对于GX-50抗皮肤衰老的应用效果进行初步探讨,实验结果显示GX-50具有一定的抗皮肤衰老作用。胶原纤维是真皮的主要部分,通过交联彼此相互连接以维持皮肤的韧性,随着皮肤衰老的发生,胶原含量减少,因此胶原含量的变化可反映皮肤的衰老状况。在20月龄小鼠背部涂抹GX-50,据Adler等的文献报道,使用NF-κB途径的抑制剂涂抹小鼠,14d后可观察到阳性改变,故本实验中用药时间确定为14d。皮肤HE染色和组织学观察显示,GX-50可以有效地使衰老的皮肤年轻化,胶原蛋白免疫组织化学实验结果表明,实验侧的胶原蛋白含量明显高于对照侧;在Westernblotting检测中同样显示,实验侧胶原蛋白含量明显高于对照侧,证实皮肤涂抹GX-50可以增加胶原蛋白的表达。我们在体外培养的人皮肤成纤维细胞中检测了GX-50作用前后细胞β-半乳糖苷酶表达量、MDA分泌量及活性氧含量的变化。β-半乳糖苷酶是一种鉴别细胞衰老的标志酶,随着衰老的发生,它在皮肤成纤维细胞中的含量会不断增加。我们的实验结果显示,GX-50组细胞的β-半乳糖苷酶含量明显低于空白对照组,说明GX-50抑制了细胞衰老的发生。H2O2是一种可诱发细胞衰老的强氧化剂,可用于细胞衰老模型的建立,用GX-50预处理后再加入H2O2与直接加入H2O2比较,可以发现经GX-50预处理的β-半乳糖苷酶染色阳性率明显降低,表明GX-50可以抗H2O2诱发的皮肤成纤维细胞衰老。氧化损伤学说是目前广泛公认的阐述皮肤衰老机制的学说,认为氧化作用造成生物膜、蛋白质以及核酸的损伤,也使皮肤代谢功能受损、胶原蛋白合成减少。此外,脂质的氧化产物MDA又可促进胶原纤维的交联,使皮肤变硬、皱缩,生成老年斑。实验发现,GX-50组细胞的MDA含量低于空白对照组,加入H2O2后诱导细胞MDA分泌量明显增加,GX-50的预处理则可以有效降低H2O2的这种诱导作用。细胞内ROS的累积可以直接诱发细胞的氧化损伤,通过ROS荧光检测,我们发现GX-50对于细胞内ROS的累积具有抑制作用。以上实验结果说明,GX-50可以在一定程度上增强人皮肤成纤维细胞的抗氧化能力,使成纤维细胞MDA分泌和ROS含量下降,减弱氧化作用引发的细胞损伤,从而延缓皮肤的衰老。综上所述,本研究证实GX-50具有抗皮肤衰老的作用,对于其药理学机制,如在细胞因子、细胞信号通路及对衰老基因表达等方面的影响还需要进一步探讨。HE染色结果显示,小鼠实验侧皮肤组织经GX-50作用后具有致密和规整的真皮层,基底细胞较多且有序(图1)。免疫组织化学染色结果显示,实验侧皮肤组织的表皮层