【地中海贫血分子诊断症研究综述6500字】

地中海贫血分子诊断症研究综述目录TOC\o"1-2"\h\u11943地中海贫血分子诊断症研究综述 111329引言 1160551地贫的分子病理学机制 2234142地贫的筛查方法 2263713.1SouthernBlot分子杂交 3175173.2跨越断裂点PCR技术 3316613.3多重PCR 3144313.4Real-TimePCR（实时荧光PCR）技术 4102774.1PCR反向斑点杂交 5163044.2基于引物延伸的检测——微测序技术(minisequencing) 5315264.3基于实时PCR平台的检测 6241774.4无创产前诊断 7245045结语 721979identificationofnovel 9[摘要]地中海贫血（是一种最常见的常染色体隐性遗传性血液病。其致病机制为珠蛋白基因发生缺陷引起珠蛋白链合成减少或缺如，使血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡，从而导致的一组溶血性疾病。该病目前尚无经济有效的根治方法，通过人群分子筛查和基因诊断，对高风险夫妇孕期胎儿进行产前诊断而避免重型地贫患儿的出生，是国内外公认的首选预防措施。因此，准确实用的分子诊断方法，是实现大规模人群分子筛查、常规基因诊断和产前诊断的前提。该文就当前地贫分子诊断技术进展进行综述，以供参考。关键词：地中海贫血；分子诊断；病理引言地中海贫血（thalassemia，简称地贫）是由于珠蛋白基因发生缺陷;致使珠蛋白链合成减少或缺如，使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡，而导致的一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，主要发生在地中海沿岸国家、东南亚、非洲和我国南方地区，保守估计全世界地中海贫血基因携带者近2亿人，其中包括我国南方广西、广东、海南等省份[1]。地中海贫血主要包括α-地中海贫血和β-地中海贫血，而口地贫危害最大。目前实验室诊断方法有筛查法、分子检测两大类，近年来均取得了较大的研究进展。本文重点综述地贫分子诊断的最新成果并对其优缺点与适用范围加以分析。1地贫的分子病理学机制人类血红蛋白为两个α类珠蛋白亚基和两个β类珠蛋白亚基而组成的四聚体，正常情况下，α类与β类珠蛋白的比例为1∶1。地贫的生化缺陷可引起α-和β-类珠蛋白比例失衡，而导致血红蛋白量减少的溶血性贫血。根据所累及的珠蛋白类型，临床上主要常见为α-地贫和β-地贫[2]。α-地贫的分子基础是α2和（或）αl基因发生突变，α珠蛋白量合成下降，β类珠蛋白过剩，导致无效造血和红细胞被破坏。α-地贫突变主要是α珠蛋白基因簇的大片段缺失（～95%），及少部分α2/αl基因点突变（～5%）[3]。β-地贫的分子基础是β基因发生突变，β珠蛋白量减少，多余的α珠蛋白沉积在红细胞膜上而造成红细胞损坏[4]。β-地贫突变主要是β基因点突变（>99.5%），极少数为β珠蛋白基因簇的大片段缺失。据此，可基于地贫的分子机制特点和血液学表型分别采用不同准确、实用的技术方法检测地贫基因突变，从而明确诊断[5]。2地贫的筛查方法随着对地贫研究的日渐深入，研究者已经总结出包括输血疗法、药物疗法、移植疗法、基因疗法等多种地贫治疗方法，但重型地贫的根治尚有一定难度，所以，除加强遗传咨询、婚育指导外，最根本的措施是作好产前诊断和筛查，杜绝地贫患儿的出生，以达到预防和优生的目的[6]。简单有效的筛查手段主要有;（1）观察红细胞形态;（2）红细胞计数;（3）血红蛋白电泳;（4）血红蛋白理化性质测定;（5）HbA3和Hb-F的定量检测等。3α地贫的分子诊断α-地贫主要（>95%）是由于α珠蛋白基因缺失导致α珠蛋白链合成减少或不合成，是典型的基因缺失型遗传病，α珠蛋白基因缺失的数目是其临床分型的依据∶正常人有4个α珠蛋白基因（aqαalaα，2个α2和2个αl）;缺失1个α珠蛋白基因（-α/αα）为静止型;缺失2个α珠蛋白基因（--/αα或-α/-α）为标准型;缺失3个α珠蛋白基因（--1-α）称为血红蛋白H病（HbH）[7];4个α珠蛋白基因均缺失（--/--）的即为HbBart's胎儿水肿综合征。引起α珠蛋白基因缺失的原因主要是DNA大片段缺失，缺失范围从2.7Kb到整个基因簇不等。中国南方省份及东南亚地区，最常见的缺失类型为--SEA（东南亚缺失型）、-α4.2（左缺失）和-α3.7（右缺失）三种。就一个单倍型而言，--SEA缺失2个α基因，-α4.2缺失1个α2基因，-α3.7缺失1个αl基因。（α基因簇结构及常见缺失类型示意图见图1）图1α基因簇结构及常见缺失类型示意图3.1SouthernBlot分子杂交这种方法是基于DNA片段的缺失而导致的限制性内切酶酶谱改变的原理，被检样本DNA经限制性内切酶酶切，再用标记探针与酶切片段杂交，观察其长度的变化而进行分子诊断。此法推出之初，是用放射性同位素标记探针，故存在放射性污染及同位素半衰期短等缺点。近年来，随着地高辛及生物素等非放射性标记技术的发明与应用，在方法学上有了一定的发展。这种方法结果准确，但DNA用量大，操作步骤繁琐，费时费力，检测通量低，不适常规检测，，现只作为一种确认手段[8]。3.2跨越断裂点PCR技术上世纪80年代发明的PCR（聚合酶链式反应）技术，具有较大扩增能力与较高的灵敏性，很快被广泛应用，α-地贫是最早应用PCR技术进行基因诊断的遗传病之一。gap-PCR的原理是在缺失区域两侧设计一对引物，正常情况下片段很长不属于PCR有效扩增范围，而当缺失时片段变短，能扩增出特异性的扩增产物，以此特异性扩增产物有无的定性分析方式进行分子诊断。这种方法，是针对缺失部位DNA序列已经清楚，缺失位置固定的缺失类型，以一对引物对应一种缺失类型的方式进行缺失类型分析[9]。然而，基因缺失型α-地贫的缺失具有明显的异质性，即具有多种缺失类型，不同患者其缺失片段有所不同，随着多种缺失类型的陆续发现，gap-PCR法可通过一对一的、多个PCR扩增反应对各种缺失类型分别进行检测[10]。3.3多重PCR在单管中进行多重PCR，可简化操作步骤，减少加样机会、降低污染的可能性，并可节约样品和试剂，降低费用。周玉球等报道的多重PCR方法。通过一次单管PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，就可在4h～5h内同时检测-SEA、-α3.7、-α4.2三种缺失类型，大大缩短了检测的时间和降低了试验的成本。陈萍等报道的的单管多重PCR可同时检测4种缺失型和2种非缺失型α地贫基因型[11]。这两种多重PCR检测方法，都是衍生于Gap-PCR原理，以一对引物对应一种缺失类型进行检测，且由于-α3.7、-α4.2这两种缺失类型的断裂点不明，仍需采用长片段扩增方式，使用特殊的Taq酶及PCR试剂[12]。区采莹等所应用的多重PCR国，则是分别基于断裂点明确的--SEA，以及αl和α2基因片段进行扩增的检测方式，扩增片段均小于1Kb，因而无须特殊的PCR体系，扩增检测时间也相应缩短，但其不能准确诊断-α/αα的静止型α-地贫。总的来说.关于多重PCR的报道.以国内文献为主，方法学的原理基本上是基于对各种已知缺失类型进行定性分析仍采用凝胶电泳观察特异性扩增条带等操作步骤[13]。3.4Real-TimePCR（实时荧光PCR）技术生物及医学科学的发展，分子诊断大规模应用，PCR等分子生物学技术已成为临床诊断及科学研究的基本手段与方法，随之而来的却是PCR产物对实验环境、实验器材及实验试剂的污染等关键性难题。针对这些问题，PCR检测过程尽可能一次性闭管完成，尽可能减少后PCR处理步骤，以避免PCR产物的挥发及扩散而导致的DNA污染。有文献报道应用SYBRGreenI实时荧光PCR结合融解曲线，检测α地贫--SEA、-α3.7、-α4.2这三种缺失类型，并应用到α地贫--SEA的产前诊断和人群筛查[14]。最近，随着高效熔链分析（HRM）技术的发明及相应仪器的问世，已有关于HRM在基因缺失型α-地贫检测中的应用，此技术是融解曲线分析的进一步发展，其灵敏度与准确性大大增高。这些将Gap-PCR结合荧光染料及PCR产物融链特性（Tm值）进行分析的方法，无须特异性的探针及凝胶电泳等后PCR处理，且成本较低[15]。由ABI公司推出的TaqMan探针技术，虽然检测成本有所增加，但源于其高特异性、可定量、可多重检测等特点，有很好的应用前景。Chan等报道了TagMan实时荧光PCR技术在α地贫--sE缺失中的应用[16]。总言之，虽然目前Real-TimePCR技术应用于缺失型α-地贫分子诊断的报道不多，但从方法学上，此技术实现了一次性闭管操作，有效防止了污染，无凝胶电泳及EB等有毒物质对操作者的损害，并可实现高通量的大规模检测，是很好的方法学研究方向。4β地贫的分子诊断1976年，Kan等利用核酸杂交速率的差异，检测了患者α珠蛋白的不同基因型，被认为是分子诊断诞生的标志性事件。1985年，具有划时代意义的PCR技术诞生，首发文章报道的就是HBB的扩增。1988年，PCR等位基因特异寡核苷酸探针（allelespecificoligonucleotide，ASO）技术出现，检测对象涉及HBB突变。1989年，具有深远意义的PCR反向斑点杂交（reversedotblot，RDB）技术出现，检测对象同样是HBB突变[17]。进入21世纪，各类新型分子诊断技术异彩纷呈，几平无一例外地用于β-地贫诊断，β-地贫俨然成为分子诊断技术的试金石。4.1PCR反向斑点杂交RDB可以同时检测样品中的多个突变，尤其适合β-地贫检测，故该技术一经出现，便在β-地贫检测中得以应用。目前国内外主流β-地贫商品检测试剂多基于RDB技术。作为20世纪80年代末出现的技术，RDB可以说是最具生命力的一种。相比而言，同时出现并得到一时应用的PCR-限制酶切片段长度多态性（RFLP）和扩增不应突变系统（ARMS）已逐渐淡出β-地贫检测领域[18]。究其原因,就在于RIDB可以利用多重PCR，一次性扩增出包含突变位点的多个片段，并在一张膜上同时对多个突变位点进行检测，易实现检测流程的标准化。相反，无论PCR-RFLP还是ARMS-PCR，在单个反应中都只能检测1个或少数几个突变，难以满足检测B-地贫数十种突变位点在通量上的要求[19]。4.2基于引物延伸的检测——微测序技术(minisequencing)HBB全长约1600bp，理论上完全可以通过直接测序实现绝大多数突变的检测。然而，尽管直接测序法在发现HBB基因突变上发挥了无可替代的作用，作为常规诊断技术，却存在成本高和耗时长的缺点。因此，迄今直接测序法仍主要作为研究工具使用。相对而言，微测序技术却在β-地贫的分子诊断上发挥了十分重要的作用。1990年Syvanen等提出的微测序技术，原理与Sanger测序类似，就是在PCR产物中加人延伸引物，通过引物单碱基延伸确定下游碱基的类型[20]。如果同时加入多个延伸引物，只要这些引物能彼此区分，就可以同时检测PCR产物中多个突变位点。微测序技术通过与毛细管电泳、芯片、质谱和变性高效液相色谱结合，已广泛用于β-地贫突变检测[21]。例如，2004年我国香港学者Chan等利用芯片平台，建立了可检测15种非缺失α-地贫突变和23种β-地贫突变的微测序体系。最近报道的ThalassoChip同样是一款基于芯片的微测序技术产品，该芯片可以一次同时检测HBB的57个突变及3个单核苷酸多态性（SNPs）位点[22]。4.3基于实时PCR平台的检测所谓实时PCR.就是在PCR扩增的同时检测其扩增产物。据此，人们很早就提出了实时PCR检测基因突变的基本方式，即分别使用不同荧光标记的野生型和突变型探针，根据扩增过程中所产生的荧光信号的类型，判断样本的基因型。该检测方式简洁直观，很快被人们接受[\23]。然而，由于实时PCR仪器的荧光检测通道数有限（一般是4到6个），检测1个突变需要2个检测通道，因此，1个实时PCR反应理论上至多能检测3个突变[24]。对于涉及数十种突变的β-地贫而言，就需要多个反应管，难以满足临床上对检测通量的要求。另一方面，探针的特异性亦难保证，当两个探针在相同环境和温度下同时检测野生型和突变型时，任何错配都将导致非特异信号的发生[25]。然而，随着MCA应用的增加，FRFT探针的局限性也逐渐显现出来。首先，此类探针需要匹配的荧光供体和受体对以实现FRET，但满足FRET的供受体对数目有限，所用标记荧光染料类型特殊，且价格高昂[26];其次，要求实时PCR仪器须有相应的FRET检测通道，由于多数实时PCR仪器的检测通道是针对单独的荧光基团设计，或者不具备针对FRET的检测通道，或者仅有单个FRET检测通道，故一直以来，多色MCA主要在专门设计的LightCycler仪器上进行。此外，双杂交探针设计困难，其中的"锚探针"可能造成检测盲区。为消除FRET探针的种种问题，Huang等通过系统比较实时PCR各类荧光探针，提出了采用自淬灭双标记探针实现MCA的新思路，摆脱了FRET探针的限制，将MCA发展为通用的多色检测技术[27]。作者据此在常规通道实时PCR仪器上，实现了16种β-地贫突变的单管检测，使MCA的检测能力迈上了新台阶。利用上述探针，厦门致善生物科技公司开发出了能够同时检测我国24种β-地贫突变的四色MCA试剂盒[28]。2011年，Xiong等报道了该试剂盒的多中心验证结果，对1022份样本进行的双盲分析表明，试剂盒的敏感度和特异度均达100%，操作简便性大大优于测序法和RDB法。同期出版的杂志配发的评论文章认为"这是一个分子诊断真实评价的出色例子"，所采用的技术"超越了β-地中海贫血本身，可以广泛用于其他基因突变的筛查"。4.4无创产前诊断β-地贫大规模人群筛查无疑为产前诊断的实施提供了条件。现阶段，产前诊断依然是通过采集绒毛、羊水等有创方式进行，由此引发的1%流产率严重妨碍其有效实施，NIPD自然成为人们心目中的理想途径。NIPD的第一步是从孕妇外周血中分离出胎儿基因组，方式有两种，一是分离出胎儿的有核红细胞，二是直接利用游离的胎儿DNA。前者由于操作复杂，近年来报道较少，但仍有成功的例子，显示该法依然有发展的空间。如2008年印度学者3）联合采用3种单克隆抗体，从7ml外周血中分离出有核红细胞，利用巢式PCR富集HBB基因片段，采用RDB法检测12种HBB基因突变，对100名孕妇中的84名成功实施了β-地贫的NIPD。5结语目前已经报道了600多种地中海贫血基因突变。这些突变具有明显的区域或人群特异性，不同的种族群体有自己独特的基因突变谱。在地中海贫血遗传诊断的临床实践中，使用的试剂盒通常针对该地区和人群中常见的突变类型。随着世界范围内越来越多的新突变被发现和报道，区域基因突变谱变得越来越复杂和多样化。因此，传统的地中海贫血基因诊断试剂盒在技术方法上存在局限性，传统的地中海贫血基因诊断不能替代地中海贫血筛查。基因型一致性的基本原则。地中海贫血基因诊断技术虽然有其局限性，但也具有快速、准确、操作简单、成本低、易于推广等优点。传统方法解决传统问题方便、成本低，操作复杂、步骤复杂、成本高的新技术可以作为传统方法的补充，弥补传统方法的缺点。总之，要充分了解各种技术的特点和局限性，并根据课题和实验室的具体情况选择合适的方法和有效的策略，从而准确、及时地确定受试者的地贫基因型，更好地了解地贫基因型。分子筛查防控和临床治疗对人群遗传诊断具有积极而深远的意义。参考文献：[1]徐湘民.见于中国人的HPFH和δβ-地中海贫血的分子基础[J].中华医学遗传学杂志，1998，15（5）∶315-317.DOI∶10.3760/j.issn∶1003-9406.1998.05.017.[2]PornprasertS;WiengkumT;SrithepS.Detectionofalpha-thalassemia-1SoutheastAsianandThaitypeDeletionsandbeta-thalassemia3.5-kbDeletionbySingle-tubeMultiplexReal-timePCRwithSYBRGreenlandhigh-resolutionmeltinganalysis[J].KoreanJLabMed,2011,31(03):138-142.DOI:10.3343/kilm.2038.[3]陈文璟，温旺荣，苏运钦等.用巢氏PCR检测防止香港型地中海贫血漏诊[J].临床检验杂志，2014，32（9∶713-715.DOI∶10.13602kijcls.2014.09.24.[4]ColosimoA,GattaV,GuidaVetal.ApplicationofMLPAassaytocharacterizeunsolvedalpha-globingenerearrangements.[J].Bloodcells,moleculesanddiseases,2011,46(2):139-144.[5]蔡武娟.联合应用Gap-PCR和MLPA技术检测β-珠蛋白基因簇大片段缺失[D].广州医科大学，2015.DOI∶10.7666/d.D714819.[6]HuangJW,ShangX,ZhaoY,etal.Anovelfusiongeneandacommona0-thalassemiadeletioncausehemoglobinHdiseaseinaChinesefamily[J].BloodCellsMolecules&Diseases,2013,51(1):31-4.[7]陈碧艳.3例罕见地中海贫血家系分子诊断和产前诊断[J].海南医学院学报，2013，19（4）∶452-456.[8]李莉艳，常清贤，靳旺杰等.十个缺失型β-地中海贫血家系的产前诊断[J].中华围产医学杂志，2012，15（10）∶616-618.DOI∶10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2012.10.011.[9]杜丽，王继成，秦丹卿等.泰国缺失型α地中海贫血的家系分析及产前诊断[C].//全国遗传性疾病诊断与优生咨询研讨会论文集.2015∶248-248.[10]阙婷，，李东明，李旺，林飞，徐钰琪，张强.香港型α-地中海贫血杂合子地中海贫血经验分析和分子机制[J].中国优生与遗传杂志，2014，22（12）∶19-20.[2017-09-05].DOI:10.13404/ki.cjbhh.2014.12.007[11]AbuzenadahAM,HusseinIM,DamanhouriGAetal.Molecularbasisofbeta-thalassemiainthewesternprovinceofSaudiArabia:identificationofrarebeta-thalassemiamutations.[J].Hemoglobin:InternationalJournalforHemoglobinResearch,2011,35(4):346-357.[12]Teh,L.K.,George,E.,Lai,MIetal.Molecularbasisoftransfusiondependentbeta-thalassemiamajorpatientsinSabah[J].Journalofhumangenetics,2014,59(3):119-123.[13]吴学东，井远方，温建芸等.造血干细胞移植治疗地中海贫血[J].中国组织工程研究，2012，16（23）∶4339-4348.DOI∶10.3969/.issn.1673-8225.2012.23.031.[14]李兵.广东省地中海贫血流行及防控现状评价[D].南方医科大学，2015.DOI:10.7666/d.Y2910853.[15]Alkindi,S.,AlZadjali,S.,Daar,S.etal.Firstreportofthespectrumofdelta-globingenemutationsinOmanisubjects-iidentificationofnovelmutations[J].Internationaljourmaloflaboratoryhematology,2015,37(2):238-243.[16]张莉，黄伟忠，唐景云等.联合应用MLPA和测序技术检测地中海贫血基因缺陷[J].实用预防医学，2014，21（7）∶779-781.DOI∶10.3969/j.issn.1006-3110.2014.07.004.[17]黄海龙，方颖迪，林娜，陈雪美，郭丹华，王燕，林元，徐两蒲.4种罕见β-地中海贫血基因检测膜条的制备及其临床应用[J].中国妇幼保健，2016，（01）∶127-129.[18]LiuJZ,YanM,WangLR,etal.Molecularprenataldiagnosisofal-pha-thalassemiausingreal-timeandmultiplexpolymerasechainreactionmethods[J].Hemoglobin,2008,32(6):553-60.[19]PornprasertS,SukunthamalaK,SacomeJ,etal.Analysisofreal-timeSYBR-polymerasechainreactioncyclethresholdfordiagnosisofthealpha-thalassemia-1SoutheastAsiantypedeletion:appli-cationtocarrierscreeningandprenataldiagnosisofHbBart'shy-dropsfetalis[J].Hemoglobin,2008,32(4):393-402.[20]PornprasertS,PhusuaA,SuantaS,etal.Detectionofalpha-thalassemia-1SoutheastAsiantypeusingreal-timegap-PCRwithSYBRGreenlandhighresolutionmeltinganalysis[].EurJHaematol,2008,80(6):510-4.[21]ChanV,etal.Quantitativepolymerasechainreactionfortherapidprenataldiagnosisofhomozygousalpha-thalassaemia(HbBartshy-dropsfetalis)Ⅲ.BrJHaematol,2001,115(2):341-6.[22]ZesongL,RuijunG,WenZ.Rapiddetectionofdeletionalalpha-thalassemiabyanoligonucleotidemicroarrayJ].AmJHematol,2005,80(4):306-8.[23]YeBC,ZhangZ,LeiZ.Oligonucleotidearrayfordetectionofcom-monseveredeterminantsofalphathalassemia[].JBiotechnol,2005,115(1):1-9.[24]SuwannakhonN,PongsawatkulK,SeeratanachotT,etal.T