乙酰胆碱激活的钾离子通道与细胞膜功能的关系

乙酰胆碱激活的钾离子通道与细胞膜功能的关系

迷路神经兴奋或乙烯（ach）可导致负肌力、负频率和负传导效应。研究显示Ach激活的钾离子电流(IKAch)在胆碱能心脏调节中起重要作用。Ach激活的钾离子通道(acetylcholine-activatedpotassiumchannel,KAch)或G蛋白调控的内向整流钾通道(GIRK)是内向整流钾通道(inwardlyrectifyingpotassiumchannels,Kir)家族中的一员;人类基因组中包括4种GIRK基因(GIRK1~4),其编码的4种蛋白质相互作用形成异源四聚体复合物,在多种组织如心脏、中枢和外周神经元、各种内分泌组织甚至非可兴奋结构如血小板中表达。哺乳动物心脏组织中只有Kir3.1和Kir3.4蛋白以2∶2组成异四聚体。由于KAch在心肌组织的特异分布及在心肌细胞中的电生理特性,在心律失常,尤其是心房颤动(简称房颤)的发生、发展及治疗选择中具有重要作用,笔者对KAch在心肌的分布特点及电生理作用作一简要综述。1离子通道的功能构成KAch异四聚体的Kir3.1与Kir3.4亚基分别由GIRK1(或KCNJ3)和GIRK4(或KCNJ5)基因编码,GIRK1和GIRK4基因分别定位于2q24.1和11q24染色体。广泛接受的是Kir3.1/Kir3.4均为功能必需的亚基,如果缺乏Kir3.4亚基,Kir3.1不能形成有功能的离子通道。Bettahi等发现基因敲除小鼠Kir3.1的降低不影响Kir3.4蛋白水平,但会降低卡巴胆碱(Carbachol,CCh)引起的IKAch,Kir3.1可增强通道活性,Kir3.4对毒蕈碱门控的钾流无显著作用。Mintert等研究细胞内Na+对KAch的影响,通过腺病毒转染在成年大鼠心房肌细胞过量表达Kir3.4亚基,获得组成性激活的-G蛋白非依赖性的电流,且与房颤动物模型和房颤患者心房肌细胞增加的基础电流有共同特性。KAch亚基与内向整流家族其他通道蛋白一样由两个跨膜功能域(S1和S2)和一个成孔区组成,每个亚基的成孔区均位于跨膜区S1和S2之间,由特定的甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸(GYG)序列组成,排成一个狭窄的使K+在水分子腔单行通过的微孔,称P区,位于P区的氨基酸对K+有选择性滤过作用;并且膜内水分子腔水平带负电残基构成的环是通道内向整流特性的基础。研究显示KAch的谷氨酸盐-精氨酸残基对之间存在盐桥,作为一个“绞索”维持严格的钾离子选择透过性。2cch、超声、ikach电流密度及心功能组织过去认为,KAch在心肌的表达只存在于心房和心脏传导系统中,但最近的研究均显示KAch在心室肌细胞也有表达,但密度低于心房组织与传导系统。研究发现在兔、人类及大鼠等多种物种的传导系统和心房肌细胞中记录到密度较高的呈内向整流特性的IKAch电流,约为心室的6倍。且左、右心房之间电流存在梯度差。Sarmast等使用膜片钳技术发现绵羊左房肌细胞IKAch电流密度大于右房,且左房Kir3.1mRNA表达较右房高约50%(P=0.03),Kir3.4左房较右房高约35%(P=0.03)。Zhao等用Western印迹和膜片钳技术对犬心房的研究得到一致结果,并且发现心耳的M2毒蕈碱受体和IKAch电流密度比心房高,作者认为心耳的这一特性使其在胆碱能引发房颤中起重要作用。但Lomax等用全细胞电流钳和电压钳技术发现在各种强度的电压下,Ach、CCh、或腺苷任一种激动剂,成年小鼠右房细胞IKAch电流密度几乎均是左房的两倍(P<0.05);CCh10μmol/L作用下-50mV时窦房结IKAch电流密度显著高于左房或右房(P<0.005),并且也认为小鼠心脏室上性结构IKAch电流密度的梯度与心房副交感神经支配分布的异质性结合,可能是迷走神经刺激增加心房复极离散导致心律失常的基础。同样为内向整流钾电流(IK1)的通道亚基Kir2.3在绵羊左房与右房的密度差异无统计学意义(P=0.35),提示在形成左、右房钾电流梯度中IKAch比IK1更重要。心房IKAch高于IK1,而心室IK1高于IKAch,有学者提出,由于钾离子的积累和消耗,心房和心室内向整流的总电流是有限的,在心室因通常记录全细胞的IK1而低估IKAch表达。Beckmann等用腺病毒转染心室表达突变的Kir2.1(一个形成IK1通道的亚基)使得IK1密度降低80%,而这些细胞中IKAch增加了4倍;腺病毒介导的RNA干扰使IK1降低,而IKAch则显著增加;2μmol/L的钡离子使心室60%IK1阻断,IKAch则增加了一倍。转录水平研究显示,Kir3.1在心房和心脏传导系统较强表达,均显著高于心室组织;Kir3.4同样在心房与蒲肯野纤维表达强于心室,但绝对表达水平较低。Dobrzynski等对大鼠、豚鼠、雪貂心肌组织化学研究也显示Kir3.1/Kir3.4在心房与窦房结均强于心室,且Kir3.1表达强于Kir3.4;单个细胞免疫荧光标记发现Kir3.1/3.4在心房与窦房结细胞膜表达,而心室肌细胞中主要沿T管分布且与M2受体共同存在。结合迷走神经纤维在心室的支配,说明迷走神经对心室肌细胞有直接作用,至于表达于心室肌T管处的KAch通道的电生理作用与心房和传导系统表达于细胞膜的通道作用是否一致还未见相关说明,但T管原本由细胞膜内陷形成,表达于其上的KAch通道在心室肌细胞中的电生理作用还有待进一步研究。3g蛋白信号调节剂KAch可被几个百日咳毒素敏感的G蛋白偶联的受体激活,包括Edg-3、腺苷受体A1和毒蕈碱M2受体;Ach、CCh、腺苷等与相应受体结合后,激活三聚体G蛋白解离为Gα亚基-GTP复合物和Gβγ二聚体,Gβγ二聚体直接与Kir亚基胞内功能域相连,通过增强Kir3.1/Kir3.4与二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)间相互作用直接激活KAch通道。最新的研究发现了对G蛋白信号负性调节的关键因子。Yang等用RGS6基因敲除小鼠研究显示,G蛋白信号调节剂(regulatorofGproteinsignaling,RGS)蛋白RGS6是必不可少的心脏副交感活化调节剂,其作用为防止副交感的过度控制和严重心动过缓,RGS6敲除增强CCh所致的心动过缓,增强CCh对窦房结细胞自发动作电位发放的抑制作用,与RGS6在G蛋白失活中的作用一致;这些效应可能是RGS6作为G蛋白对KAch通道活化的负性调节剂的结果,RGS6缺陷的小鼠心房肌细胞IKAch激活和失活的时程显著缩短,并且IKAch脱敏的程度亦显著降低。Posokhova等进一步证实RGS6/Gβ5复合物而非单独的RGS6蛋白,通过加速心房肌IKAch电流失活动力学而负性调节M2R-IKAch信号。RGS6/Gβ5敲除的小鼠IKAch失活延迟;RGS6/Gβ5复合物和Kir3.4免疫共沉淀,提示RGS6/Gβ5复合物与M2R-IKAch信号间可能有通过Kir3.4的直接的蛋白-蛋白相互作用;在G蛋白负性调节中起重要作用的RGS6/Gβ5复合物若发生功能障碍,可能导致IKAch的过度激活不能受到相应抑制,引起副交感活性增强所致的改变与疾病,对更好地理解心脏疾病的病理生理及开发正确的治疗提供了一个选择。磷酸肌醇,如PIP2,调控许多离子通道活性,最早发现门控依赖于与磷酸肌醇直接相互作用的通道即内向整流钾通道中的一种(KATP),且Kir通道是对磷酸肌醇的依赖性研究最广泛的离子通道家族。PIP2是维持Kir通道功能的重要因素,腺苷、Ach、钠离子、pH值等因素均通过PIP2调节Kir通道,PIP2增强KirN端和C端相互作用,并将其系于细胞膜胞浆面,调节机械门控通道。新近的研究显示它莫西芬即通过干扰离子通道和PIP2间相互作用,而抑制HEK-293细胞表达的Kir3.1/3.4通道活性。4静息作用机理IKAch与IK1同属强内向整流性钾流,IKAch整流特性弱于IK1。钾电导(K+通透性)因细胞膜去极化而降低的现象称为内向整流,其本质是指Kir通道的作用为稳定静息膜电位、动作电位(AP)3期复极,对AP平台期很少或无影响,在不阻止AP发生的情况下使静息电位趋于钾离子平衡电位(Ek)。内向整流特性使通道在膜电位负于Ek时膜电导增强,膜电位正于Ek时膜电导减弱(不同于电压依赖性钾通道)。目前认为整流的分子机制是通道门控受多胺等有机阳离子(精胺、精脒、腐胺)及Mg2+调节,多胺等与通道水分子腔隙整流调控器氨基酸残基结合,改变通道的开放状态,这种特性不仅使细胞保存了细胞内钾离子,且利于钾离子的内流。4.1心肌细胞兴震性心肌兴奋性受静息电位与阈电位之间的差值影响,IKAch使细胞膜超极化而降低心肌细胞的兴奋性。Dobrzynski等用电流钳技术研究显示Ach和腺苷两种激动剂均使雪貂心室肌细胞AP时程(APD)缩短和收缩力降低,使心肌细胞兴奋性降低;且Ach通过IKAch和IK1共同调节心肌兴奋性,即Ach在膜电位正于Ek时,激活IKAch,负于Ek时,抑制IK1,而膜电位接近Ek时,Ach对膜电流影响不大;雪貂心室细胞模型显示IKAch激活后,刺激阈值由-1.15nA上升至-1.80nA,当刺激增加到-1.80nA,可触发AP,但较短,当IK1降低75%时,-1.55nA即可触发AP,所以,同时抑制IK1可恢复兴奋性。同样CCh可增加诱发AP必需的除极电流量,CCh诱发的APD与对照相比,显著缩短。4.2cch对bs-brr的影响心肌细胞的自律性受细胞最大复极电位与阈电位的差距及4期自动去极化速度的影响,当最大复极电位增大或钾外流衰减减少,使AP4期自动去极化速度减慢,自律性降低。胆碱能受体刺激诱导的心搏频率减低(BRR)依赖于Gi蛋白的激活和其通过蛋白激酶A(PKA)信号与钙离子循环耦联或与IKAch耦联的程度:在CCh低浓度时,IKAch不明显,BRR主要由cAMP介导的、PKA依赖的钙离子信号抑制;当CCh浓度增大到大于30nmol/L时,PKA依赖钙离子信号的抑制和IKAch的激活结合显著抑制了心搏频率。Lomax等研究显示CCh10μmol/L作用下-50mV时窦房结IKAch电流密度显著高于左房或右房(P<0.005)。但组织化学研究显示大鼠和豚鼠窦房结Kir3.1/Kir3.4标记比心房弱,这对于Ach对心脏的重要作用是降低窦房结的自律性存在争议,但作者认为窦房结很多离子通道密度均低,不需要同心房一样多的毒蕈碱钾通道即可实现对心率的调节。4.3ach对心肌的负性变力效应和相对重要性IKAch的激活降低心肌收缩力,Ach对豚鼠离体心房肌和心室肌细胞及离体心肌组织收缩力均有降低作用,但这种效应并不存在于所有心室肌细胞,且心房对Ach比对心室敏感(P<0.01),这与上述KAch的分布在心房大于心室的结果一致;Ach对心肌的负性变力效应是通过缩短APD实现的,因为当细胞膜被电压钳钳制时,Ach对雪貂和大鼠心肌的收缩力没有影响。研究证明IKAch上调促成房颤相关的心房收缩功能障碍,抑制IKAch可能是预防低收缩力相关的血栓栓塞并发症的新靶点。5tertiape-q抑制剂胺碘酮与决奈达隆均可以阻断G蛋白激活剂鸟苷酸γ硫代磷酸盐(Guanosinegammathio-phosphate,GTPγS)和CCh引起的IKAch电流,且决奈达隆的阻断作用比胺碘酮高,但都不是KAch选择性药物。IKAch的特异性阻滞剂Tertiapin-Q是天然肽类毒素Tertiapin的不被氧化的衍生物,对IKAch有较高的选择性,对IKAch的敏感性是IK1的100倍,Tertiapin-Q可在纳摩尔浓度水平抑制IKAch,在心动过速重构模型中终止房性快速性心律失常,不影响心室的复极,广泛用于KAch相关的实验。新型抗心律失常药NIP-151抑制表达Kir3.1/3.4的HEK293细胞IKAch电流,半抑制浓度(IC50)为1.6nmol/L,对快速延迟整流钾流(IKr)作用较弱(IC50=57.6mmol/L);可剂量依赖地终止实验性迷走神经刺激或乌头碱诱导的房颤,显著延长心房有效不应期(ERP),对心室ERP无显著影响,与IKr阻断剂多非利特(同时延长心室ERP)相比有显著优势,可能用于房颤的治疗。它莫西芬可通过干扰离子通道和PIP2间相互作用,而抑制HEK-293细胞表达的Kir3.1/3.4活性,且对KAch作用的机制和能力在心房肌细胞和HEK-293细胞相当,它莫西芬对IKAch的抑制作用可能减弱副交感神经对心脏的调控。尽管如此,当前尚无可应用于临床的纯IKAch选择性抑制剂。6koch与心率障碍之间的关系6.1房颤时心功能电重构的离子流改变房颤是最常见的心律失常之一,APD缩短、传导减慢、折返形成均与易诱发房颤相关。房颤时心房电重构的离子流改变有瞬时外向电流(Ito)、L型钙电流(IcaL)、钠离子流(INa)的降低和K+离子电流的增加等。由IKAch功能失调所致的副交感神经张力调节障碍越来越被接受为房颤发病中的主要因素。6.1.1cch诱导的ikachi结构及参数变化房颤时内向整流电流可能发生改变的学说最早由VanWagoner等提出,由于其在房颤患者的左房肌细胞发现内向整流活性增加。后续研究发现,慢性房颤患者左、右心房肌细胞基础内向整流K+流均显著增加。Bosch等报道房颤患者心房肌细胞背景内向整流电流IK1与乙酰胆碱诱导的成分均增加。相反,Dobrev等的结果显示,与窦性心律相比,慢性房颤患者右房肌全细胞基础电流增加,CCh激活的M受体介导的IKAch减少,增加的基础内向整流钾流是IK1通道表达上调和开放率增加,以及IKAch组成性激活两者的结果;慢性房颤患者心房肌KAch亚基mRNA和蛋白水平表达下降,对Ach的应答钝化,可能是由于快速心房率引起IKAch组成性激活的适应性调节修饰,即机体拮抗房颤时电重构ERP缩短的代偿机制之一。慢性房颤患者心房肌Tertiapin-Q敏感的成分大于窦性心律,单通道记录显示,IKAch在慢性房颤心房有较显著的组成性激活,记录到自发的通道开放,通道开放率增高,但不伴随基础电流特性的改变。慢性房颤患者组成性激活的IKAch的产生,可能是促进维持心律失常(而非引发)的心房重构的结果。6.1.2at-重构对小鼠血清中kir3.1/3.4信号通路非认同功能的激活肺静脉肌袖(PVs)心肌细胞在房颤中起重要作用,Ehrlich等曾在AT-重构犬PVs记录到本质不确定的超极化激活的时间依赖性内向电流(IKH),后续研究对电流特性做了鉴定,显示AT-重构PVs和左房观察到的超极化激活电流的活化时间呈弱的电压依赖性(在-120到-90mV之间,活化时间为386±14到427±37ms,平均半活化电压为-93±4mV,反转电位约-84mV,阿托品对其无影响,IKH可被选择性Kir3通道阻滞剂Tertiapin-Q阻断(IC5010.0±2.1nmol/L),为IKAch的组成性激活;PVs和左房的Kir3.1/3.4蛋白表达无差异,但IKH在PVs大于左房,可能原因为调节因素而非表达水平。Cha等发现AT重构犬左房肌细胞中胆碱能刺激诱发的额外电流减少,但组成性激活的IKAch成分(IKH)增强;实验中AT-重构犬心房标本可诱发房性快速性心律失常,而Tertiapin-Q显著降低诱发的快速性心律失常持续时间,延长心律失常周期,对AT所致的APD缩短有显著延长作用。Voigt等进一步对AT-重构犬心房肌细胞单通道研究显示,AT通过增强自发的通道开放,而增加激动剂-非依赖性的组成性激活的IKAch单通道活性,通道开放频率(fo)和开放概率(Po)增加,分别为非重构对照的7倍和10倍,形成了AT-重构时显著增加的IKAch电流,为先前研究观察到的AT对肉眼可见的IKAch的效应,以及相关复极缩短和Tertiapin-Q可抑制房颤等提供了分子基础;AT-重构对通道的其他特性和Kir3.1/Kir3.4任一通道亚基mRNA或蛋白质的表达无显著影响;AT-重构中胆碱能刺激的IKAch通道单通道开放率增加减少,是由于AT-重构标本IKAch胆碱能应答的钝化,并且提示应答改变发生于通道门控水平,而非通道亚基表达或自身电导性的改变。6.1.3磷酸化-依赖性通道调节的调控持续高心房率改变了通道门控而增加无M胆碱能受体刺激时的IKAch单通道开放率,慢性房颤患者和AT-电重构犬的单通道特性改变相似,提示二者有组成性激活的共同分子基础。IKAch的调节很复杂,慢性房颤或电重构时IKAch组成性激活的确切机制还不清楚,以下是几个普遍认识的IKAch组成性激活的机制:①由于组成性激活的IKAch不受阿托品阻断M受体所影响,所以IKAch基础活性是激动剂-非依赖性的机制;②由于在AT-重构犬心房肌细胞,百日咳毒素与三磷酸鸟苷(GTP)缺乏对基础电流的Tertiapin敏感成分均无影响,故不太可能是因为Gi蛋白的Gα和Gβγ亚基呈激动剂-非依赖性的分离增加的结果;③慢性房颤与AT犬一致,IKAch的激动剂-非依赖性激活需要三磷酸腺苷(ATP),百日咳毒素处理不能抑制ATP对IKAch的激活,因此磷酸化-依赖性通道调节的修饰可能促进慢性房颤中组成性激活的IKAch的产生;④蛋白激酶C(PKC)功能异常可能在临床房颤患者致纤颤组成性IKAch的产生中起重要作用,研究显示心房肌细胞Kir3.1亚基形成一个大分子复合物,可对IKAch功能局部调节,此大分子复合物包含PKA、PKC、钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependentproteinkinaseⅡ,CaMKⅡ)、蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的催化亚基,房颤时,此大分子复合物的数量和质量组成可能发生改变,导致IKAch的异常调节。增强组成性IKAch通道活性的确