类转录激活因子效应物核酸酶的研究进展

类转录激活因子效应物核酸酶的研究进展

21世纪以来，由于胚胎透明、发育迅速、后代众多，斑点鱼逐渐成为遗传发育研究领域的重要模式生物。然而,由于斑马鱼的胚胎干细胞(ES)技术不够成熟,因此还无法像小鼠那样通过ES途径进行基因打靶。最近十几年来,人们始终在不遗余力地尝试通过各种途径在斑马鱼中制备/筛选突变体,并且已陆续建立了多种方法,例如,ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)化学诱变、TILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes)、反转录病毒插入诱变、基因诱捕(Genetrap)和ZFN(Zincfingernuclease)介导的定点突变等。但是这些方法都有各自的局限性,还没有一种能够实现对斑马鱼的任意基因进行靶向修饰。直到2009年,有两组科研人员同时揭示了来自植物病原菌——黄单胞杆菌(Xanthomonasspp.)中TALE(Transcriptionactivator-likeeffector)家族的蛋白结构单元与DNA靶序列之间存在一一对应的特异性识别并结合的秘密,基因组定点突变技术才打开了新的局面。迄今仅短短3年的时间,人们已经利用TALE蛋白这种特殊的DNA结合结构域跟FokⅠ核酸酶结构域融合构成人工TALE核酸酶(TALEnuclease,简称TALEN),建立了理论上能够对任意物种进行基因打靶的新技术,并且成功地在体外培养的人类细胞、线虫、斑马鱼、大鼠、果蝇等17个物种中实现了基因组定点突变(详见本期另文发表的综述“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术”)。由于斑马鱼的反向遗传学技术相对于果蝇、线虫等经典模式动物而言更亟待完善,因此,TALEN技术的建立对于斑马鱼研究领域更有着不同寻常的意义。TALEN技术应用的关键步骤之一是TALEN表达载体的构建。天然TALE蛋白DNA结合结构域的核心部分一般由1.5~33.5个基本重复单元(Repeatunit)串联而成,其中每个单元包含34个左右的氨基酸残基。每个重复单元中第12位和13位的氨基酸残基称为重复可变双残基(Repeatvariabledi-residue,简称RVD),它决定了该单元识别DNA碱基的特异性。常用的RVD包括NI(AsnIle)、HD(HisAsp)、NG(AsnGly)和NN(AsnAsn),分别对应识别碱基A、C、T和G。目前人们已报道了多种方法用于构建TALE串联重复序列(TALErepeats),其中“单元组装法”(UnitAssembly,UA)是本实验室建立的一种简便、可靠的构建TALE串联重复序列的方法。该方法的起始材料只需要分别对应于识别4个碱基的4个TALE基本单元模块,采用3个常见的限制性内切酶SpeⅠ、NheⅠ和HindⅢ,通过简单的酶切—连接反应,即可像搭建积木那样串联组装出任意长度、任意顺序的TALE重复序列。本方法最大的优势在于原理简单、可操作性强,不需要任何特殊的试剂或仪器,只要掌握了常规的分子克隆操作技术,就可以用本方法组装出用户指定的TALE串联重复序列。下面详细介绍本实验室采用单元组装法构建人工TALEN表达载体并在斑马鱼中进行基因组定点突变的具体实验流程与经验。需要指出的是,用本方法构建的TALEN同样可以用于高效、定点突变其他物种或细胞的基因组。1材料表面1.1实验材料感受态细菌:用于构建TALEN表达载体。性成熟的斑马鱼:用于突变斑马鱼内源基因。建议选用实验室常用的近交系品种。1.2谷物和试剂1.2.1基于pcs2-1-tafk表达载体的回复突变体的构建TALE单体质粒系列(TALE基本单元模块载体)(图1):均为氨苄青霉素(Amp)抗性。共4种,分别称为pA(NI)、pC(HD)、pG(NN)和pT(NG)。由本实验室在pMD18-T(TaKaRa)载体骨架的基础上构建,作为组装TALE串联重复序列的起始载体。TALE单体在连入pMD18-T载体时方向可正可反,并不影响TALE重复序列的构建。在我们目前所用的4种载体中,pC、pG和pT都是从M13-47到RV-M的方向连入,而pA则是从RV-M到M13-47的方向插入。这类质粒的代表性序列详见补充材料。pCS2-0.5TALE-FokⅠ表达载体系列(简称pCS2-FokⅠ表达载体)(图2):均为氨苄青霉素(Amp)抗性。需成对使用(pCS2-PEAS系列和pCS2-PERR系列配对)。由本实验室在pCS2载体的基础上构建。可作为骨架载体,用于插入组装好的TALE串联重复序列,以便最终构建出TALEN表达载体。该系列载体除了含有FokⅠ切割结构域的编码序列之外,还带有CMV启动子/增强子、SP6启动子、来自SV40的核定位序列(NLS)、3×FLAG标签(pCS2-0.5TALE-PEAS系列载体)或HA标签(pCS2-0.5TALE-PERR系列载体)等功能元件。此外,该载体中还预先组装了TALE重复结构域中3′端的最后0.5个重复单元(识别TALEN靶点中的最后一位碱基),因此,该系列载体包括分别识别A、C、T、G等4种末位碱基的4对(共8种)载体(表1)。这类质粒的代表性序列详见补充材料。构建和检测TALEN载体所需的引物见表2。1.2.2培养基和培养基NEB限制性内切酶:HindⅢ-HF、KpnⅠ、Nhee-HF、NotⅠ-HF或SacⅡ、SpeⅠ-HF。琼脂糖、DNAmarker、1×TAE、氨苄青霉素、LB琼脂培养基、LB液体培养基、2×TaqMasterMix(含染料)(康为世纪,CW0682)、碱性磷酸酶(CIAP,TaKaRa,D2250)、1mol/LTris(pH8.0)、50mmol/LNaOH、70%乙醇、超纯水(ddH2O,18MΩ)1.3设备和材料1.3.1taen活性检测所需的仪器(1)构建TALEN所需仪器:超净工作台(细菌操作用)、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex)、NanoDrop(ND-1000Spectrophotometer)、PCR仪(2)在斑马鱼中检测TALEN活性所需的额外仪器:显微注射装置、体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机1.3.2材料细菌培养皿、移液器、移液器吸头、Eppendorf离心管、PCR管、显微注射针。2实验过程2.1tale重复序列的构建由于TALE重复序列的结构是串联重复、首尾相接的,因此,理论上可以将重复单位中的任意两个相邻的氨基酸残基作为串联重复序列的起点和终点进行结构组装,最后只需要把第一个重复单位和最后一个(或0.5个)重复单位的两端补齐,即可构成完整的TALE重复序列。根据这一原理,我们选择TALE重复单位中第11位的丝氨酸残基(Ser,S)到下一个重复单位中第10位的丙氨酸残基(Ala,A)之间的序列作为新的重复单位(称为“替换单元”,图3A)进行TALE重复序列的构建。这样,我们就可以利用氨基酸密码子的简并性,在“替换单元”的一端(N端)设计一个SpeⅠ的酶切位点,另一端(C端)设计其同尾酶NheⅠ的酶切位点。利用同尾酶可产生相同的粘性末端、但是连接在一起后又会丧失原有的酶切位点的特点,通过反复的酶切—连接反应,就可以将所需要的重复单元依次组装到一起(图3B)。最后,将TALE重复序列跟FokⅠ切割结构域的编码序列整码(In-frame)连接,即可构建出完整的TALEN编码序列及表达载体(图3C)。更多关于构建、应用和检测TALEN的各种方法的信息可参考本期另文发表的综述“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术”和由本验室建立的人工核酸内切酶(Engineeredendonuclease,EEN)的综合数据库与知识库网站EENdb(/)。2.2选择和确认scope目标点2.2.1tale蛋白表达载体的构建应用TALEN技术的首要步骤是选择并确认基因组的靶位点。由于TALEN中的FokⅠ核酸酶结构域通常以二聚体的形式起作用,因此,TALEN结合位点(或称TALE结合位点)也需要成对选择。这样,一个完整的TALEN靶位点(或简称靶点)就包含一个左侧TALE结合位点及其0位的t碱基和一个右侧TALE结合位点及其0位的t碱基,以及它们之间的间隔序列(Spacer)。其中,左、右两侧的TALEN单侧靶点(即TALEN结合位点)也可称为“半位点”(Half-site)。除非有特别说明,本文下面提到的TALEN靶点均指由左、右两个TALE结合位点(半位点)及其两侧0位的t碱基加上中间的Spacer所构成的完整的靶序列(图4)。TALE/TALEN单侧靶点(即半位点)及其0位的t碱基的结构通式为:5′-t(N)nN-3′。应用本方法构建TALEN表达载体建议遵从如下原则选择靶点(图4):(1)半位点的方向:TALE蛋白自N端到C端识别并结合DNA单链的方向是从5′端到3′端(图4)。为了便于FokⅠ结构域形成二聚体,TALEN靶点中左、右两侧半位点的单链方向必须是相反的,即一个半位点设计在正义链上,另一个半位点则需设计在反义链上。(2)半位点的长度:单侧靶点(半位点)最好控制在11~16bp(即n=11~16;这里并不包括0位的t),这样即能保证靶向的特异性,也不需要太多的构建步骤。合成识别大于16bp靶点的TALE重复序列和相应的TALEN需要增加酶切—连接的步骤,花费额外的时间和精力;如确有必要也可以选择。(3)0位碱基(需要特别指出的是,这个0位的t并不需要组装对应的TALE单元模块):紧邻单侧靶点(半位点)5′端上游的第一个碱基(称为第0位的碱基)必须为t(图3、图4)。(4)末位碱基:单侧靶点3′端的最后一个碱基(对应于TALE中的最后0.5个重复单位)尽量选择T(因为天然存在的TALE家族蛋白的靶序列中末位为T的占大多数)(图4)。(5)Spacer的选择:本方法采用的TALE重复序列与FokⅠ切割结构域之间相连接的氨基酸残基数为63,因此,Spacer的碱基数最好控制在12~21bp。同时,如果计划用酶切的方法检测TALEN的活性与效率,还需要在Spacer中找到一个单一的限制性内切酶位点,并且尽量让这个酶切位点位于Spacer的中间位置。(6)靶点预测工具:可以通过Bogdanove实验室提供的TALEN靶点预测网站(/)进行靶点预测,也可以先通过NEB公司的网站(/NEBcutter2/index.php)找到酶切位点,再在酶切位点的两侧人工寻找TALE结合位点。选择TALEN靶点时需要考虑的其他问题可参考本文后面的“3常见问题和注意事项”。2.2.2taen打靶实验由于TALEN的序列特异性较高,靶序列中只要有一个碱基出现错配(Mismatch)就有可能较大幅度地降低TALEN的活性。因此,选定靶点后,强烈建议实测一下每个实验室自己养殖的实验材料(例如斑马鱼、果蝇等动植物个体或体外培养细胞)的实际序列,根据实测序列调整靶点的序列,并且最好用同一批(测序确认正确,并且靶序列是纯合的)实验材料进行TALEN打靶实验,以避免SNP的影响。(1)确认靶点在基因组中的唯一性:在Ensembl网站上分别用单侧靶点序列进行Blast比对,确认该序列在所选用的物种的基因组中是单一位点。否则建议重新选择靶点。(2)PCR扩增靶点序列:从准备打靶的实验材料中PCR扩增靶点及附近的序列。引物距离靶点最好大于100bp,PCR产物最好不要超过500bp,并且扩增后为单一条带。(3)测序确认靶点序列:PCR产物直接送去测序(不要经过TA克隆),根据实测序列调整或重新选择靶点。注意应选择测序结果显示为单一序列的实验材料(动植物个体或细胞株)确认靶点,不要选择含有SNP或其他变异的杂合子。(4)检测酶切位点的效率:如果计划采用酶切的方法检测TALEN活性,则需要对上述PCR产物进行酶切验证。要求尽量酶切完全,并且电泳后能明显与原条带区分开。(5)遴选实验材料:根据后续打靶实验的需要,采用上述的PCR与测序策略筛选出足够量的靶点正确且为纯合的实验材料(动植物个体或细胞株)。2.3talen配置2.3.1tale重复序列的构建按示例的格式填写经前述步骤确认过的TALEN靶点信息,并设计构建方案。(2)根据构建方案选择两个相邻的TALE重复载体,分别进行双酶切与电泳、切胶回收(示例3,图3B)。用NheⅠ和HindⅢ双酶切处于TALE重复序列N端(对应识别5′端靶序列)的TALE质粒,回收得到TALE骨架片段(N端TALE,包含TALE元件和载体骨架;需回收的长度为2.7kb的骨架+m×102bp的TALE元件);用SpeⅠ和HindⅢ双酶切处于TALE重复序列C端(对应识别3′端靶序列)的TALE质粒,回收得到TALE元件片段(C端TALE,仅包含TALE元件;需回收的长度为(m×102+16)bp的片段)。此处,m代表载体中所含的TALE重复单元数。注意:(1)也可以采用其他的酶切组合构建同样的TALE重复载体。例如,可以采用G+TTA的组合构建GTTA载体。不过,TALE单载体经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后得到的TALE单体片段只有100多bp,如果小片段DNA回收的得率不高,会影响到后续的连接。因此,最好不要采用C端为单载体的组合(例如,最好不要采用GTT+A的组合)。(2)剩余的胶回收产物可标注清楚后保存于-20℃,以便用于构建其他位点。(3)连接、转化,涂氨苄青霉素平板(Amp抗性),37℃培养12h。(4)挑取单克隆菌落,液体培养基培养,用M13-47和RV-M引物对进行菌液PCR鉴定。注意:PCR的延伸时间要根据载体中TALE重复单元的数目(m)进行调整(表3):一个TALE单元有102bp,而引物还会在质粒骨架上额外扩增168bp,这样,PCR产物的总长度就是(102×m+168)bp。(5)电泳检测,将PCR鉴定正确(预期产物长度参见表3)的剩余菌液扩大培养,提取质粒,即完成了本轮组装,得到了本轮所需的TALE重复序列中间载体。注意:经菌液PCR鉴定正确的质粒可以作为中间载体存放在-20℃冰箱,以备构建其他位点时使用。(6)重复步骤(2)至(5),延长TALE串联重复序列,直至达到所需的顺序与数目(图5)。所得到的载体称为pMD-TALE(图5)。【示例4】从单载体开始,通过4轮酶切—连接构建tnikb左侧半位点TALE重复序列(图5)(除最后0.5个重复单元之外)的步骤:注意:由于TALE中的最后0.5个重复单元已经预先构建到pCS2-FokI系列载体中,因此,每一个TALEN单侧靶位点中3′端的最后一个碱基(对应于最后0.5个重复单元)不在上述构建范围之内!例如,上例中的tnikb左侧半位点的序列应为15个碱基:5′-GTTATTTTATCCCCT-3′,在这一步骤中,只需要组装对应于前14个碱基5′-GTTATTTTATCCCC-3′的TALE重复单元即可。(7)TALE串联重复序列pMD-TALE构建完毕后,挑单克隆做PCR、电泳检测,选取大小正确的克隆送测序检验(用通用测序引物M13-47和RV-M双向测序)。注意:由于TALE重复序列较长且重复性很强,需要选择一个技术较好、质量有保证的测序公司,才能保证将双向的TALE序列拼接完整。2.3.2tale重复序列片段的回收和鉴定为了提高FokⅠ的酶切活性、TALEN靶向的特异性,本方法采用了只能以异二聚体的形式起作用的两种Sharkeyform的FokⅠ变体(PEAS和PERR)配对使用。此外,pCS2-FokI载体的选用还同时取决于半位点中3′端的最后一个碱基。(8)根据两个TALEN半位点最后一位碱基的性质选用合适的pCS2-PEAS和pCS2-PERR载体对,用NheⅠ分别单酶切,电泳、切胶回收(5.5kb)。例如:对于tnikb的左侧半位点,由于其最后一位碱基为T,因此应选用pCS2-T-PEAS或pCS2-T-PERR。(9)CIAP去磷酸化,快速DNA产物纯化试剂盒回收后备用。(10)用SpeⅠ和NheⅠ双酶切“2.3.1”中第(7)步组装好的TALE重复序列载体pMD-TALE,电泳后切胶回收备用。回收(n×102)bp大小的条带(n表示pMD-TALE载体中的TALE重复单元数),得到TALE重复序列片段。(11)将上述去磷酸化的pCS2载体骨架与双酶切后回收的TALE重复序列片段连接、转化,涂氨苄青霉素平板,37℃培养12h。(12)菌液PCR鉴定TALE重复序列片段的连入方向:根据“2.3.1”中第(7)步组装出来的TALE重复序列中的最后一个完整重复单元(3′端)的性质选用上游引物(A-For、T-For、C-For或G(NN)-For)。如果这个重复单元跟FokⅠ载体上预设的0.5个重复单元的RVD相同,则需要向前(5′端方向)寻找一个与该RVD不同的序列作为引物。例如:对于tnikb的左侧半位点,由于其最后一位碱基为T,而最后一个完整重复单元识别的是C,因此应选C-For作为上游引物。下游引物63dn位于pCS2-FokⅠ的骨架上。不同位置的上游引物,PCR延伸的时间不同,PCR产物的长度也不同。例如,上游引物对应最后一个完整的TALE单元时预期应扩增出~350bp的条带;而每向5′端方向位移一个TALE重复单元,PCR产物就会增加102bp。如果TALE重复序列连入的方向正确,就能扩增出条带,否则无法扩增出条带。可据此鉴定连入方向正确的菌落。同时用SP6通用引物测序确认。(13)酶切检测TALE重复序列片段的连入情况:利用pCS2-TALEN载体上的KpnⅠ和NheⅠ两个酶切位点对pCS2-TALEN载体进行双酶切鉴定,可以检测在上一步的酶切—连接反应中是否发生了TALE重复序列的串连或断连,同时也可以用来鉴定TALE重复序列连入pCS2-FokⅠ载体的方向(图6)。pCS2-TALEN质粒骨架大小约为5kb,TALE重复序列的大小为(n×102+443)bp。2.4taen活性检测与斑点鱼突变体筛选2.4.1表面活性剂的选择和pcr的扩增这一步首先通过体外转录合成编码TALEN的mRNA,再将成对的mRNA显微注射到斑马鱼单细胞受精卵中,2~4d后提取基因组DNA,采用限制性内切酶酶切法检测TALEN位点是否发生突变,同时可以估算TALEN的突变效率。这一步也可以选用直接克隆测序等其他方法代替酶切检测。(14)线性化TALEN表达载体:通过NotⅠ或SacⅡ酶切线性化鉴定正确的pCS2-TALEN载体对(需要先确认一下NotⅠ或SacⅡ为单一酶切位点)。线性化完全后可直接用快速DNA产物纯化试剂盒回收。(15)体外转录TALENmRNA(SP6,Ambion)、回收,溶于20~30μLDEPCH2O中,Nanodrop定量。(16)将左、右两侧半位点的一对TALENmRNA混和,显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中,得到F0胚胎(注射量建议:50~150pg/半位点)。同时留一些未注射的同批胚胎作为对照。(17)取2~4dpf注射后表型正常的胚胎,1~5个胚胎为一组,提取基因组DNA,PCR扩增靶点周围的序列(最好用“2.2.2”中鉴定过的引物)。(18)酶切检测TALEN在靶点造成的突变。如果有完整的、未切开的PCR条带(前提是未注射的对照胚胎的PCR产物能够全部被切开),则说明靶点可能发生了突变。将未切开的条带切胶回收,连入T载体,测序鉴定靶点的突变情况(图8)。未切开的PCR条带占所有条带的荧光亮度的百分比可大致反映TALEN的突变效率。2.4.2taen突变株的筛选和活性鉴定这一步首先是检测F0(Founder)外交得到的F1胚胎,以便筛选出生殖细胞中带有(可遗传的)靶位点突变的F0成鱼。将这样的F0成鱼外交得到的后代(F1)养大,再通过剪尾逐条检测F1的靶位点序列,即可筛选出携带可遗传TALEN突变的斑马鱼个体。(19)将TALEN活性>1%(最好能>10%,这样更便于筛选)、存活率较高(不低于70%)的同批F0胚胎饲养至性成熟(一般电泳结果中肉眼可见未切开的条带即可认为TALEN活性>1%)。(20)与野生型(WT)成鱼外交,收集F1胚胎。每条F0建议检测20个以上的F1胚胎。3解决问题和注意事项3.1基因编码算法(1)靶位点选择因基因而异,一般而言,靶点靠前比较好,尽量在基因编码序列(CDS)的前2/3,但是要在ATG之后,这样突变等位基因(Allele)可编码的多肽产物较短,更接近无效突变(Nullmutation)。同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框(in-frame)的起始密码子。(2)靶点也可选择在内含子和外显子的交界处,以破坏靶基因的剪接。(3)还要注意靶基因是否有多个不同的剪接变体或转录变体,注意需要突变的是某一个剪接变体或转录变体,还是所有的剪接变体或转录变体。3.2taen的特异性关于TALEN的脱靶(Off-target)效应,目前的研究并不多。从仅有的几篇报道来看,TALEN的特异性很高,脱靶效应远远低于ZFN。可通过前述的TALEN靶点预测网站(/TALENT/)预测特定基因组中潜在的脱靶位点,然后通过深度测序检测TALEN的脱靶效应。3.3基于tale的小序单元(1)TALE重复序列组装过程中是以pMD18-T载体作为骨架。该载体骨架仅用于承载TALE重复序列,并不用来表达TALEN蛋白,因此,TALE重复序列的插入方向并不影响其进行酶切—连接的组装。如果用该载体骨架上的通用引物对TALE重复序列(包括起始载体和中间载体)进行测序验证,则只要测序结果正确即可,无论所得到的序列跟预期序列等同还是反向互补,均可用于后续的组装步骤。(2)为了尽量降低序列的重复性,本实验室采用的TALE重复单元中除了RVD之外,某些其它位点(例如第四位的氨基酸残基)的序列也有可能存在一些差异(例如第四位的氨基酸残基有可能为A、D或E),但是并不影响使用(图10)。(3)本方法(“单元组装法”)在载体构建上有一个独特的优点:载体构建过程中每一轮产生的中间载体(甚至酶切、回收的产物)都可以保留下来,用于其他TALEN的构建。这样一方面可以避免重复构建中间载体,另一方面可以节省时间和精力,提高构建效率。TALEN载体构建得越多,中间载体就会积累得越多,这样新TALEN的构建效率也会越来越高。例如,如果预先构建好全部16个双单元载体,就可以直接从双单元开始构建TALEN,而不需要从单载体开始,这样就可以节省一轮的时间;如果除了4个单载体之外,还预先构建好全部的双单元(16个)、三单元(64个)和四单元(256个)载体,那么只需要两轮就可以构建出16个完整的TALE重复单元,比从单载体开始可节省一半的时间。3.4nhe/tale重复序列载体的稳定性NheⅠ、SpeⅠ和HindⅢ等内切酶也可以选用其他公司的产品。根据我们的经验,用NheⅠ和HindⅢ双酶切TALE重复序列载体时有时会出现多余的条带(预期应该只有一个条带),这有可能是NheⅠ或HindⅢ的星活性造成的。如果出现这种情况,建议改用NEB的HF(highfidelity)酶,同时减少质粒的用量(例如<1μg),酶切时间也不要太长(例如控制在2h之内)。3.5taenmrna的注射量对于新构建的TALEN对,可尝试注射不同的剂量的mRNA,从中选取一个最佳剂量用于制备斑马鱼突变体。一般而言,mRNA的注射量越大,TALEN作用的效率就越高,不过,斑马鱼胚胎的畸形率也会随之上升、存活率下降;每半位点TALENmRNA的注射剂量超过100pg后胚胎畸形率的上升会更为明显。根据我们的经验,剂量范围可控制在50~150pg/半位点,一般100pg左右为最佳剂量,可兼顾胚胎的存活率和TALEN的效率。在这个剂量下,斑马鱼胚胎的存活率一般可达到90%以上。4斑马鱼幼鱼的人工诱导与亲水性基因的产生本实验室在原来已发表的文章基础上,增加了针对最后一位碱基(对应最后的0.5个TALE重复单元)为A、C和G的FokⅠ载体,并构建出了所有的三单元TALE载体(64个)和四单元TALE载体(256个),这样既扩大了靶点的选择范围,又可以节省载体的构建时间。目前,本实验室利用单元组装法已成功构建了100多对针对斑马鱼不同基因组位点的TALEN,经内切酶检测,突变成功率大于70%(未发表数据),这与Cade等最近报道的结果类似。本实验室一半以上的TALEN位点的突变效率大于30%,有的甚至接近100%,这充分显示了在斑马鱼中应用TALEN技术的高效和简便。其中,本实验室大部分未检测到活性的TALEN靶点的信息可参考EENdb网站(/)。斑马鱼性成熟一般需要3个月的时间。如果希望