中药药代动力学研究与评价技术体系的构建

中药药代动力学研究与评价技术体系的构建

几千年来，中医药在人类健康事务中发挥了积极作用。随着中药现代化研究的不断深入,复方丹参组分配伍机制研究、复方黄黛片抗肿瘤作用分子机制与成分协同整合作用机制研究等一批标志性的中药现代化研究成果的涌现,我们有充足的理由相信中药将在未来的生物医学领域及人类的健康事业中发挥更加重要的作用。单成分、单靶点药物的研发模式已经受到了越来越多的挑战,创新药物研发成本不断上升,而研发效率却逐渐降低的反常现象引发了学者们深刻的思考,“单靶点、高亲和力、高选择性”的药物研发理念受到了越来越多的质疑。取而代之的“多靶点、低亲和力、低选择性”的药物研发模式将可能成为未来全球创新药物研发的主体。尽管西方学者们倡导“单成分、多靶点”药物的研发理念,但其核心思想与终极目标与“多组分、多靶点”中药本质上是相通的。因而,充分汲取中医药的理论精髓及几千年的临床用药经验,运用现代科学技术手段,加强对多组分、多靶点中药的研究与开发将成为我国药物研发的主流模式之一。药物研发模式的转变对现有的新药创制与评价体系提出了全新的要求,单成分、单靶点的药代、药效评价技术体系显然不适用于多成分、多靶点药物评价,“中国中医药创新发展规划纲要(2006-2020)”中明确指出建立符合中药自身特点的研究、评价方法和标准规范体系是当前中药现代化研究的主要任务之一。基因组学、蛋白质组学及代谢组学等系统生物学技术的发展和引入,以及“网络药理学”(Networkpharmacology)等新思路的提出为多组分多靶点中药的整体药效评价与研究带来了曙光。然而,如何建立符合多组分、多靶点中药自身特点的中药整体药代动力学评价技术体系,目前尚没有明确、公认的研究思路和技术方案,对于中药药代动力学学科本身的关键科学问题还没有形成一个清晰的认识。近5年来,本课题组在国家自然科学基金重点项目(中药复杂药效物质的确证及整体药代动力学研究新思路与方法,No:30630076)及“十一五”国家科技支撑计划(“生脉方”作用机制和配伍评价方法研究,No:2006BAI08B04-05)的资助下,围绕中药药代动力学研究的关键科学问题,在建立符合中药自身特点的药代动力学评价技术体系方面进行了一些探索性的研究,本文试在分析中药药代动力学学科关键科学问题的基础上,结合近年来的研究实践,探讨如何建立符合中药特点的整体药代动力学评价技术体系。1药代动力学的主要研究范畴经典的中药药代动力学(简称中药药动学)定义是借助于动力学原理,研究中草药活性成分、组分、中药单方和复方体内吸收、分布、代谢和排泄(ADME)的动态变化规律及其体内时量-时效关系,并用数学函数加以定量描述的一门边缘学科。但实际上,随着现代药代动力学学科的发展,新技术的不断渗透及与交叉学科的结合,药代动力学的研究范畴已远超出了经典的ADME研究,药代动力学研究已经成为创新药物研发链上不可分割的重要组成部分。中药药代动力学研究也不能仅局限于对中药有效成分的体内经时过程与ADME的定量描述性研究,中药药代动力学在中药现代化研究链上发挥着“桥梁学科”的作用,在中药体内药效物质基础,多组分、多靶点作用模式与机制,方剂组分配伍机制等关键科学问题研究中均起着重要作用。1.1药代动力学研究的意义中药含有众多有效成分,而各有效成分的药代动力学特征大相径庭,用所谓主要有效成分表征中药的整体药代动力学行为显然不合理,而通过多组分药代动力学研究所获得的各成分孤立药代动力学参数,对于中药临床给药方案的设计又缺乏实质性的指导意义。当前,各中药制剂的临床给药方案大多是根据经验判断的,说明书上标示的给药方案与临床实际使用方案通常存在很大差异,依据半衰期等重要药代动力学参数进行临床给药方案设计是药代动力学研究的基本作用,但由于中药整体药代动力学的研究思路与技术体系的缺乏,中药药代动力学研究在中药临床给药方案设计中的作用尚未得以实现。1.2在化学与环与化学药物药代动力学研究相同,阐明中药所含主要有效组分在生物体内外的ADME特性与机制,是中药药代动力学所面临的关键科学问题之一。由于在中医药理论、中药资源等方面的优势,创新中药研发将成为我国创新药物研发的主体模式,而在创新中药研发早期,通过药代动力学研究手段,对有苗头的候选成分进行体内外ADME研究,将极大提高创新中药研发的成功率与效率,这一点与药代动力学在化学药物研发中的作用相似。与化学药物不同的是,中药组分ADME研究还应注重多组分共存时各主要成分的ADME特性研究,并应通过“构动关系”(QSPR)研究,揭示各类有效成分尤其是结构相似/相关成分的体内外ADME共性规律,这对于现代组分中药的研发具有重要意义。1.3中药成分及关键化合物含量的检测尽管中药通过调节肠道菌群等途径在肠道发挥药效作用近年来受到了关注,但多数情况下中药有效成分需要吸收入血、到达靶器官并作用于相应靶点后才能发挥整体药效作用。实质上,许多中药成分尽管在药材中含量较高,但由于生物利用度低、代谢消除迅速等原因难以在体内达到有效浓度。相应的,中药成分可能在生物体内通过广泛代谢转化生成活性代谢产物而发挥药效作用,中药发挥药效作用的物质基础应是在生物体内具有适宜动力学特征的原形成分组及活性代谢物组,因而,中药药代动力学研究对于揭示中药体内复杂药效物质基础具有重要作用。1.4剂量组配作用模式及对药物组分配伍作用的影响中药方剂“君、臣、佐、使”及“七情和合”的配伍规律与机制研究,对于揭示方剂组方奥妙、指导现代组分复方中药的研发具有十分重要的科学意义。从理论上分析,方剂组分配伍作用可发生在化学、药代、药效等各个层次,但方剂组分配伍作用模式大致可分为两类,一是影响生物体内有效组分的质和量的构成,另一是在药代/药效环节产生协同、拮抗等相互作用。对于药代配伍作用而言,方剂组分间可在ADME等各环节产生相互作用,表现为影响组分的生物利用度、改变分布特性、调节体内动态药效物质组的构成等方面,最终因为药效物质的改变而导致药效作用的变化,因此药代配伍研究是阐明方剂配伍机制的一个重要途径和手段。1.5生物酶/转运体系统中药含有众多的组分,大多在体内产生广泛的代谢/转化,因而中药对生物体药物代谢酶系统和转运体系统产生多种形式调节作用的倾向性很大。当生物体药酶/转运体系统发生改变,则将极大改变相应底物药物的体内处置与动力学特征,进而影响药效作用甚至产生毒副反应。近年来,西方国家对于中药/植物药与化学药物代谢相互作用的研究十分重视,在我国中西药联用是一个十分普遍的现象,其对临床疗效的影响与潜在的安全隐患问题不容忽视。因此,深入研究中药组分对主要代谢酶/转运体系统的调节作用,指导临床中西药联用时给药方案的设计具有重要科学意义。2中药药代动力学研究的现状近30年来,国内学者围绕中药药代动力学研究开展了一些有益的探索性研究,“生物效应法”、“标志性有效成分法”等研究思路和技术方法在一定程度上推动了中药药代动力学学科的发展,本课题组近年来围绕中药药代动力学研究的关键科学问题,在研究思路和关键技术方面进行了一些探索性的研究,以下对相关研究结果进行扼要综述。2.1药代动力学研究如何定量表征中药的整体药代动力学行为,获得相应的整体药代动力学参数,从而指导临床给药方案的制定,是中药药代动力学研究的首要任务。原有的“生物效应法”虽然在一定程度上表征了中药的整体动力学特征,但对于大多数中药而言,难以选择适宜的客观、量化生物活性指标,这一方法的局限性很大。针对这一问题,作者提出了“中药多组分整合药代动力学研究”的新思路,该项技术思路包含三个重要内容:(1)标志性成分(PK/PDmarkers)的确定:综合评价中药所含成分的药代动力学特性与药效作用,选择具有确切药效作用和适宜药代动力学特征的成分作为标志性成分;(2)多组分药代动力学研究:在建立高灵敏度同步定量分析技术的基础上,开展多组分药代动力学研究,获得各成分的药时曲线;(3)模型整合:整体思路是根据各成分对整体药代和药效的权重贡献,选择合适的建模方法,对各成分药时数据进行模型整合,获得能够最大程度表征中药整体动力学特征的参数。本课题组以血塞通注射液及脉络宁注射液为模型药物,开展了相关研究工作。在分析血塞通注射液成分构成的基础上,进行药代/药效筛选(结合文献数据),确定三七皂苷R1,人参皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1为标志性成分,进而基于LC/MS技术建立了5个组分的同步定量分析方法,开展了大鼠、健康志愿者的多组分整合药代动力学研究,根据AUC这一反映药物在生物体内暴露程度的药代动力学参数计算各成分的药代权重系数,进而运用数学模型进行多组分整合,获得了能够最大限度表征制剂整体行为的血药浓度-时间曲线与动力学参数。为了证明基于AUC自定义权重系数模型整合的合理性,作者进一步开展了临床脑中风患者的药动-药效结合研究,结果表明,血塞通注射液整合血药浓度与整体药效指标具有良好的相关性,反映了成分的综合与整体贡献。在此基础上,运用群体药代动力学研究方法,发现滴注速率、体重等因素对整合药代动力学参数与临床疗效有较大影响,提出了血塞通注射液的优化临床给药方案,初步证明中药药代动力学研究在临床中药制剂给药方案设计与优化中应用的可行性和重要意义。在针对脉络宁注射液的相关研究中,作者进一步拓展了基于药效权重系数及药代/药效联并权重的模型整合方法,并通过整体动物模型的PK/PD结合研究证实了联并整合权重的优越性。但考虑到中药整体药效作用评价自身的复杂性,如何科学评价中药的整体PK/PD特征仍需进一步探索新的模型整合研究方法。2.2中药复杂组分快速检测与鉴定技术中药药效物质基础研究是中药现代化研究的核心科学问题之一,活性导向下的药效物质分离与筛选一度成为中药药效物质基础研究及创新药物发现的主流模式,尽管有过青蒿素等经典的成功范例,但这一模式的成功率与效率受到了越来越多的质疑。针对这一问题,作者提出了基于“体内外物质组关联网络分析”的中药药效物质基础研究与创新中药研发思路,即在全面分析中药组分及其在生物体内形成的代谢物组的基础上,确定在生物体内具有适宜药代动力学特征的成分组作为潜在药效物质组,并通过化学信息学手段,阐明中药成分组与其在生物体内的潜在药效物质组之间的网络对映关系,针对体内潜在药效物质组进行多重药效筛选与确证,从而在体外、体内两个层次揭示中药的复杂药效物质基础。该项技术思路的核心是提出应在阐明中药体内外物质组对映关系的基础上,针对体内具有适宜动力学特征的物质组进行药效筛选与确证,这一策略应能提高从中药及方剂中进行创新中药发现与现代组分中药研发的成功率与效率。进行中药体内外物质组关联分析及最后的药效物质组的确证需要多学科研究技术手段的结合,包括分析化学、药代动力学、药效学及化学信息等。中药物质组分析的难点在于其所含成分的多样性、成分间物化性质迥异、缺乏相应的对照品进行结构确证等因素。尽管近年来各种分析技术手段得到了长足的发展,但中药复杂组分的快速检测与鉴定仍是一个艰巨的挑战。本课题组基于最新的高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱技术(LC-IT-TOF/MS),利用其可同步进行多级碎裂和精确质量测定的功能,分别针对中药制剂中的目标性成分(targetcompounds)和非目标性成分(nontargetcompounds),建立了中药复杂组分快速检出与结构推测的分析技术策略。针对生脉注射液中的人参皂苷类及五味子木脂素类成分,建立了诊断离子搜寻与结构外推策略,快速鉴定了30种人参皂苷类成分及20种木脂素类成分。而脉络宁注射液中已知的目标性成分很少,作者基于LC-IT-TOF/MS技术,根据中药组分通常以结构相关类群方式存在的事实,建立了共有离子搜寻与成分分类、桥接策略,该策略可大大提高从庞大的化合物数据库中进行结构检索与匹配的效率。运用该项技术策略,从脉络宁注射液鉴定出87种成分,为中药复杂成分的分析提供了具有普适性的技术方法。在体外物质组分析技术研究的基础上,开展了中药在生物体内的复杂动态物质组及与体外物质组的关联分析研究,提出对所获得的复杂指纹谱进行逐层分析的策略,即首先去除内源性干扰成分、重构原形成分与代谢产物谱,针对代谢产物的分析采用II相、I相、降解产物及复合代谢产物等逐层推进的鉴定方式,并根据常见代谢途径和代谢原理,利用多级碎裂与精确分子量等质谱信息,基于Matlab编写了中药复杂代谢产物与代谢途径分析的化学信息处理软件,为中药在生物体内产生的复杂物质组分析、代谢网络分析奠定了强大的分析技术基础。相关技术策略已成功应用于脉络宁注射液及人参皂苷总提物等中药复杂组分的体内外物质组关联分析研究工作。但如何针对中药在生物体内的动态物质组,建立高通量、多维、多层次药效筛选体系,进行中药体内药效物质的确证是正在探索的关键技术难题,随着这一技术的突破,将有望对中药复杂药效物质基础研究产生突破性的影响。2.3基于cyp3a的药代动力学研究目前针对方剂配伍研究主要体现在化学和药效层次,而方剂药代层次的配伍研究大多局限于研究配伍对某个成分的体内动力学过程影响的描述性研究,而对药代配伍发生环节与机制研究甚少,这种描述性研究难以形成对方剂药代配伍的规律性认识。中药方剂所含成分的复杂性给方剂药代配伍研究带来了巨大的困难,要研究一个方剂内所有组分间的配伍作用几乎不太可能,因而建立科学的研究方法学体系,掌握组分间的配伍作用规律,进而预测和推断方剂药代配伍作用则具有十分重要的意义。针对这一问题,作者提出了基于机制的中药方剂药代配伍规律研究,即围绕可能发生药代配伍作用的机制环节,包括药物代谢酶、转运体、肠道菌群、蛋白结合等,建立合适的体内外ADME筛选与评价体系,着重研究方剂中佐使药对君药主要药效物质组的药代配伍作用,这对于方剂复杂药代配伍规律研究将起到“化繁为简”的效果。根据这一技术策略,针对生脉方的药代配伍规律开展了初步的研究,首先通过系列体内外代谢研究,确定了CYP3A介导的羟化代谢为君药人参中三醇型皂苷的共有、主要代谢途径,进而研究了佐使药五味子中主要组分木脂素对肠肝CYP3A的调控作用,发现木脂素类成分短期给药对肠道CYP3A具有显著的抑制作用,显著提高人参三醇型皂苷的口服生物利用度,从而部分解释了佐使药五味子协同、提高君药人参药效作用的配伍机制。通过这一策略,掌握方剂组分间的主要配伍规律,对于在现代组分中药研发中科学合理利用有益的药代配伍,尽可能避免不利配伍,从而最大限度发挥组分间的协同、整合作用,无疑具有重要意义。此外,在现代临床治疗中,中药与化学药物联合应用的情况越来越普遍,因此中西药联合应用中潜在的药代相互作用受到了国内外研究人员的广泛重视。近年来,不断有研究发现许多天然产物及中药可通过代谢环节影响相应化学药物的药动学行为,国外针对葡萄柚汁和圣约翰草对CYP3A4的调控作用是这方面的典型范例。丹参、人参、五味子等常用中药也被发现对药物代谢酶系统有较大的影响,因而加强中药组分对药酶、转运体调节作用的研究对于临床安全用药具有重要意义。作者采用底物探针法及体外人肝微粒体共温孵体系对丹参制剂及丹参主要成分对人体CYP亚型的调节作用进行了研究。结果发现健康受试者长期口服丹参片(2周)并不改变茶碱的药动学过程,提示丹参片制剂对CYP1A2无显著影响。而体外人肝微粒体共温孵体系的实验结果却发现丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮是CYP1A2的竞争性抑制剂,丹参素是CYP2C9的竞争性抑制剂,隐丹参酮是中等的CYP2C9的混合型抑制剂。综合分析体内外实验结果,虽然丹参成分对多种药酶具有抑制、调节作用,但其整体是否会产生相应结果取决于这些成分在体内能否达到相应的浓度,通过对丹参片组分的药代动力学研究发现,丹参酮IIA等脂溶性成分的血药浓度极低,因而尽管其对CYP1A2等具有抑制作用,但在整体给药时的影响不大。考虑到以水溶性成分为主的丹参注射液内含有浓度较高的丹参素,其对CYP2C9底物的抑制作用在临床联合用药时应予以重视。2.4中药有效成分的药代动力学特征创新中药研发将成为我国未来创新药物研发的主体,因此,如何充分利用药代动力学研究技术,提高创新中药研发的效率与成功率,创新中药与化学合成药物的药代动力学评价有何不同,是需要深刻思考的问题。目前,创新中药的临床前药物代谢