微生物活细胞在电化学生物传感器上的快速响应

微生物活细胞在电化学生物传感器上的快速响应

微生物细胞的快速检测是一个值得关注的问题。传统的显微镜下微量池计数法致操作者疲倦,存在较大的主观误差,且不易区分活菌细胞与死菌细胞;平板接种培养后菌落计数法方法客观、结果可靠,但需要恒温培养至少24h以上方可获得结果,因而无法满足需要现场甚至是实时获得检测结果的场合,如发酵过程控制、鲜奶中杂菌总数测定等等。用于活菌总数检测的生物传感器已有报道,笔者在前人工作的基础上,研制了一具电化学生物传感器,可将微生物活细胞新陈代谢产生的电子转移转换为传感器的电流输出,并设计、研制了单片计算机控制、带恒温测量池的专用测定仪,研究了传感器对大肠杆菌、啤酒酵母、霍乱弧菌及卡介菌苗的响应,实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及鲜牛奶中的细菌总数,结果分别与显微镜下直接计数法及平板接种24h菌落计数法相吻合,但测量时间仅需数分钟,基本做到了现场、实时的测定。1实验和方法1.1试剂1.1.1磷酸缓冲溶液pbs磷酸二氢钾(KH2PO4)和磷酸氢二钠(Na2HPO4)均为分析纯,用去离子水配制成0.1M,pH=7.00的缓冲溶液。1.1.2电子增益手段1,6-二氯酚啶酚钠盐购自Fluka公司,用去离子水配成1%的溶液。1.1.3阴性溶液铁氰化钾(K[CN]4Fe)为分析纯,用去离子水配成过饱和溶液。1.2菌株和鲜牛奶啤酒酵母细胞由桂林漓泉啤酒厂提供,大肠杆菌和霍乱弧菌由广西区卫生防疫站细菌科提供,卡介菌苗由桂林市结核病防治研究所提供,消毒鲜牛奶购自桂林市场。1.3温度和测温背景图1是专用测定仪的原理框图。恒温测量池采用水浴式PID控温,可在室温加5℃至60℃设定测量池温度T,控温精度为±0.02℃;数字表头采用四位半LED,电流测量范围0.01～99.99μA;仪器可设定测量池搅拌速度Vr(10～300rpm)、电流采样间隔时间t′(1～999s)和测量总时间Tt(1～9999s),可选择“I-t”和“[dI/dt]-t”两种测量方式。1.4单一晶圆片图2是电化学生物传感器的中纵剖图。传感器主体用直径2.8cm有机玻璃棒车制;阳极系直径2.2cm铂片,贴于有机玻璃棒的一端;阴极为0.5cm×0.5cm×1.5cm的石墨条,置于充满过饱和铁氰化钾溶液的阴极室内。阴极室侧面有一直径3mm的小孔与外界通,此小孔用离子交换膜贴堵使阴极液不致外泄但可与阳极进行离子交换。阳极和阴极均用细银丝导出与测量仪的输入端相接。1.5内标样品的测量方式向测量池中加入磷酸缓冲溶液3.5ml,电子媒介溶液1.0ml,设定搅拌速度、温度、电流采样时间和测量总时间,选择测量方式(I-t或[dI/dt]-t),按“测量”键读出本底电流值,加入待测样品溶液500μl,按“测量”键即可。2结果与讨论2.1啤酒发酵原液对啤酒酵母的电流-时间i-t响应曲线图3是测量液中含与不含葡萄糖时大肠杆菌的I-t响应曲线。可见,测量液中含葡萄糖时,电流响应大大增加。图4是测量液中加与不加啤酒发酵原液时啤酒酵母的电流-时间(I-t)响应曲线,可见,测量液中含啤酒发酵原液时,电流响应大大增加。葡萄糖是许多细菌包括大肠杆菌的营养源,啤酒发酵原液是啤酒酵母的最佳培养基,实验结果验证了本传感器是拾取微生物活细胞新陈代谢过程中电子转移的原理,其电流值反映了微生物活细胞新陈代谢的程度,提示使用本传感器系统可以进行快速的菌种或培养基组分筛选。2.2不同微生物的电流加速度-时间响应曲线[dI/dt]-t代表传感头输出电流加速度与时间的关系,反映了微生物活细胞新陈代谢的速度。图5是霍乱弧菌、啤酒酵母细胞、大肠杆菌和卡介苗的电流加速度-时间([dI/dt]-t)响应曲线。可见,霍乱弧菌在1min内即达到响应平台并开始下降,啤酒酵母和大肠杆菌在10min内达到响应平台并开始下降,而卡介苗则在60min后才达到响应平台并开始下降。结果说明:几种微生物活细胞的电流加速度-时间([dI/dt]-t)响应顺序与这几种微生物的新陈代谢速度顺序是相吻合的。实验结果提示本传感器可用于微生物活细胞生长特性的快速评估。2.3两种方法对于新鲜牛奶中杂菌总数的检测效果分析啤酒发酵过程中尤其是发酵中后期,需要对发酵罐中的酵母活细胞浓度进行定时测定,以确定终止发酵的最佳时间。啤酒厂现行的酵母活细胞数测定均采用台盼蓝染色后的显微镜下直接计数法,此法虽简便易行,但操作人员的情绪波动和疲劳极易导致主观误差的产生。本实验使用啤酒厂提供的标准啤酒酵母制备标准曲线,在发酵车间现场测定了发酵罐中酵母细胞数12h的动态变化,其结果如图6。结果表明传感器法与显微镜下直接计数法测得的结果有高度的一致,但传感器法可大大减轻检验人员的劳动强度,也避免了主观因素导致的误差。另从图6可以看出,传感器法测得值均偏低于显微镜下直接计数法的测得值,提示本传感器仅对有生长活性的活菌响应,因而用传感器法监测发酵罐中活菌量较显微镜下直接计数法更有意义。随着人民生活水平的提高,新鲜牛奶的消费越来越普及,而新鲜牛奶中微生物的污染也就受到人们越来越多的关注。国家标准规定特级生鲜牛奶中细菌总数不得超过5×105cells/ml,消毒鲜奶中细菌总数不得超过0.3×105cells/ml。由于平板培养菌落计数法需要培养24h才能获得细菌总数的检验结果,许多中小型的奶场往往在细菌培养结果出来之前已将产品销出,因而给人民健康带来潜在的危害。为探讨本传感器用于新鲜牛奶中杂菌总数快速测定的可能,从市场上购得桂林市某乳品厂生产的消毒鲜奶增菌培养分离后,在本传感器系统制备标准曲线如图7。用此标准曲线测定了同一产家的20袋鲜奶,同时用常规平板培养24h菌落计数法做平行对照测定,所得结果如表1。对两组数据进行相关分析,相关系数R=0.979,说明两种方法测得的结果有较好的一致性,使用本传感器系统完全可以代替传统的平板培养24h菌落计数法对消毒鲜牛奶中的杂菌总数进行快速、现场的测定。由于测定一份样品的时间不超过10min,本传感器系统除可用于乳品厂对新鲜牛奶的杂菌总数的快速测定外,若对仪器整机进行便携式设计,将可帮助工商管理人员和卫生监督监测人员对新鲜牛奶的卫生质量实现所谓的“柜台边监