不同提取方法提取菊花总糖的比较研究

不同提取方法提取菊花总糖的比较研究

氨基化合物是自然界最常见的有机化合物。它不仅是植物组织的主要成分，也是人类和动物最重要的食物来源。与沉积物、蛋白质和养分一起形成生命的分子基础。多糖作为一种“生物应答效应物”,具有非常重要的生理活性。菊花多糖自古就可作为一种中草药,被用来防治感冒、菌痢、肠炎、便秘、冠心病、高血压等多种疾病,现代药理研究表明菊花多糖是一种良好的氧自由基清除剂,具有良好的预防保健作用。常用的菊花多糖的提取方法多采用热水提取法,张桂青等讨论了常规条件下热水浸提菊花多糖的最佳工艺条件。随着现代技术的发展,超声波和微波技术的应用也逐渐渗透到植物有效成分的提取领域。超声波法提取糖类化合物的主要原理是由于超声波产生的空化效应能产生强大的冲击波,促使细胞内含物释放到溶剂中,从而加速了细胞内多糖的萃取过程。微波提取的作用原理是利用空间电场和磁场的高频振荡,加速被提取组分向提取溶剂界面的扩散速率,从而提高提取效率。张海艳等采用微波提取海带多糖,提高了提取率,降低了成本。唐娟等研究了超声波协同纤维素酶提取黑木耳多糖的方法,得出了超声波提取木耳多糖的最佳工艺。但将超声波和微波应用于菊花总糖提取的研究较少,我们在前人研究的基础上,运用超声波、微波、常规热水提取3种手段,并采取不同的工艺组合方法,提取菊花总糖。通过比较其得率大小,建立了菊花总糖的最佳提取工艺,为菊花糖类化合物的进一步纯化和精制打下基础。1材料和方法1.1实验原材料菊花,购自北京林业大学科技有限公司。将菊花烘干、粉碎,作为菊花总糖提取实验材料。1.2主试剂浓硫酸、苯酚、葡萄糖、α-萘酚、氢氧化钠、硫酸铜,酒石酸钾钠,所用试剂均为分析纯。1.3超声波发生器和循环水生物污染721可见分光光度计(上海第三分析仪器厂);WP700(MS-2089T)微波炉(乐金电子(天津)电器有限公司);KQ-500B超声波发生器(江苏省昆山市电山湖镇);AR2140分析天平(美国Ohaus公司);SHB-循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);800B离心机(上海安亭科学仪器厂);恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)。1.4菊花总糖提取菊花总糖粗提液的制备:称取粉碎的菊花干粉15份(分为5组,每组3份,每份5g)作为提取样品。分别用热水提取法、超声波法、微波法、超声波预处理-热水提取法和超声波-微波联用法提取菊花总糖。将每份总糖粗提液分别离心,抽滤,浓缩至60mL备用。1.5测定了菊花总糖含量1.5.1浓硫酸溶液的制备精确称取干燥至恒定质量的葡萄糖5mg,置于100mL容量瓶中,定容,摇匀。准确从中分别吸取0.3,0.6,0.9,1.2,1.5,1.8mL分置于6个25mL容量瓶中定容,获得6个梯度浓度标准溶液。从中各吸取2.0mL标准溶液(2.0mL蒸馏水做空白),加入5%苯酚1.0mL,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0mL,摇匀置沸水浴15min,冷水中冷却30min至室温,于490nm波长处测定其吸光度。以葡萄糖浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。标准曲线吸光度值如表1。1.5.2浓硫酸与糖溶液的分离取5种菊花总糖粗提液各1mL,置于5支试管中,每管均加入5滴α-萘酚溶液,混匀。分别沿管壁慢慢加入浓硫酸1mL,使浓硫酸与糖溶液清楚的分为两层,观察两液面间的变化。取5只试管分别加入浓度为1.25mol/L的氢氧化钠溶液(溶有浓度为0.6mol/L酒石酸钾钠)和浓度为0.14mo/L的硫酸铜溶液各1mL,混匀,再分别加入0.5mL粗提液,摇匀,沸水浴3min,观察溶液颜色变化。1.5.3浓硫酸-苯酚分光光度法精确量取上述各浓缩液0.5mL,定容于100mL容量瓶中,作为样品供试液。精确吸取各样品供试液2mL,分别置于5支试管中(蒸馏水做空白),加入5%苯酚1.0mL,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0mL,摇匀置沸水浴15min,冷水中冷却30min至室温,于490nm波长处测定其吸光度。1.5.4稳定性试验取样品供试液,按照“1.5.3”测定方法,将同一份反应液间隔一定的时间,测定吸光度值。1.5.5提取液浓度的测定总糖得率=C·W·V/M,其中:C为溶液浓度(单位:mg/mL),W为稀释倍数,V为提取液的体积(单位:mL),M为称取固体菊花干粉的质量(单位:g)。1.5.6数据的统计分析采用SAS软件,对5种方法的提取率进行统计分析。2结果与分析2.1时域方程介绍根据“1.5.1”的方法绘制标准曲线,得出曲线方程如图1。以溶液浓度(C)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标绘制标准曲线,得出曲线方程为:A=12.74C+0.025(R2=0.997)2.2突出保护羧酸系统中的氧化酶对各种粗提液进行糖类化合物鉴定,在提取液与浓硫酸的界面均出现紫色环,说明提取液中含有糖类化合物;而且各个样品溶液与氢氧化钠溶液和硫酸铜溶液反应,均有砖红色沉淀产生,说明提取液中含有还原性糖。2.3菊花总糖提取率测定取备好的菊花干粉3份(每份5g),置于3个烧瓶中,分别加入125mL水,85℃下,恒温水浴锅中回流提取2.5h,得菊花总糖粗提液。对每份粗提液分别进行吸光度值测定,记作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。计算总糖得率,其结果如表2。由表2可知,在上述实验条件下,热水法提取菊花总糖的得率是7.92%。2.4超声法提取菊花总糖的效果取菊花干粉3份(每份5g),置于3只锥形瓶里,分别加水125mL,设定超声波功率500W,在60℃温度下间歇提取两次,每次15min,得菊花总糖粗提液。对每份粗提液分别进行吸光度值测定,记作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,计算总糖得率,其结果如表3。由表3可知,在上述实验条件下超声波法提取菊花总糖的得率是6.94%,比常规热水法的提取率低0.98%。原因可能是用超声波提取时,提取温度为60℃,这个温度低于热水提取法的提取温度85℃,菊花总糖未能充分溶解在溶剂中,从而导致提取率较低。2.5微波法提取总糖的最佳时间取菊花干粉3份(每份5g),置于3只烧杯中,分别加水125mL,设定微波输出功率700W,置于解冻档间歇提取3次,每次2min,得菊花总糖粗提液。对每份粗提液分别进行吸光度值测定,分别记作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,计算总糖得率,其结果如表4。由表4可以看出,在上述实验条件下,微波法提取总糖的得率是7.33%,比常规热水法的提取率低0.59%。原因可能是由于植物结合水汽化温度比较高,致使小部分糖分子焦化,从而导致提取率略低。但是两者的提取率相差并不是很大。但是在试验的过程中,用微波提取时,如果微波加热时间控制不好,容易产生暴沸现象。在这种情况下就会导致物料损失,降低提取率,且操作安全性比较低。2.6超声-热水提取法和微波-微波联用法提取菊花总糖的比较取菊花干粉3份(每份5g),置于3只锥形瓶中,分别加入125mL水,在超声波功率500W,温度60℃的实验条件下间歇提取30min后转移至烧瓶中,85℃下热水回流提取30min,得菊花总糖粗提液。对每份粗提液分别进行吸光度值测定,分别记作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,计算总糖得率,其结果如表5。由表5可知,在上述实验条件下,超声波预处理-热水提取法提取菊花总糖得率达到9.86%,比常规热水法的提取率高1.94%。原因可能是提取物先在超声波作用下,使细胞破碎完全;再在85℃热水中浸提,使糖类比较充分的溶解到提取剂中,从而使得率提高。该提取方法缩短了提取时间,提高了提取效率。取菊花干粉3份(每份5g),置于3只锥形瓶中,在超声波功率500W,60℃条件下,超声波法间歇提取30min后,再用微波间歇提取3次,每次2min,得菊花总糖粗提液。对每份粗提液分别进行吸光度值测定,记作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,计算总糖得率,其结果如表6。由表6可以看出,在上述实验条件下,超声波-微波联用法提取菊花总糖的得率为8.98%,比常规热水法提取率高1.06%。但是,在试验的过程中却发现:使用超声波-微波联用法提取菊花总糖时,提取液黏度比较高。可能是因为两者同时作用,促使其他细胞内容物连同糖类物质一起释放到溶剂中,致使提取液黏稠度增高,使分离操作的难度增加,不利于总糖的进一步分离纯化。2.7波后提取率测定在试验的过程中,对每份粗提液进行吸光度值测定时,每隔10min读取一次吸光度值,连续测4次,实验结果稳定。使用SAS软件对5组数据进行分析,结果如表7。以常规热水处理组做对照,由表7可以看出:超声波处理组、微波处理组与常规热水处理组相比较,提取率差异不显著(p<0.05)。超声波预处理-热水处理组、超声波-微波处理组与常规热水处理组相比,结果差异显著(p<0.05),提取率大于常规水提组。3超声-微波法提取菊花多糖的最佳提取方法实验结果显示,用5种方法提取菊花总糖时,超声波法、微波法的提取率与常规水提法相比,差异不是很大;而超声波预处理-热水提取法、超声波-微波联用法的提取率明显高于常规热水法的提取率。但是使用超声波-微波法提取菊花多糖时,会造成提取液黏稠度增高,不利于下一步的分离纯化。综合各方面