泛酸生物合成的研究进展

泛酸生物合成的研究进展

泛酸，也称为总酸或维生素b，是一种亲水维生素。1931年,Ringrose等开始研究泛酸,到1940年确定其结构并化学合成了泛酸。由于食物中泛酸含量丰富,很少出现缺乏症,因此对泛酸生物学性质的研究工作进展相对缓慢。随着分子生物学的发展,寻找新型抗菌药物靶点的研究不断取得新进展,泛酸生物合成途径开始受到重视。泛酸的生物合成途径包括四种酶,分别是酮泛解酸羟甲基转移酶(PanB)、酮泛解酸还原酶(PanE)、L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)和泛酸合成酶(PanC)。到目前为止在大肠杆菌(Escherichiacoli)和分支结核杆菌[Mycobacteriumtuberculosis(MTB)]中的这些酶的生化特征和结构信息都取得了详细的研究结果,在一些重要的致病菌(如结核分枝杆菌,疟原虫,脑膜炎双球菌和幽门螺旋杆菌等)中与泛酸合成相关酶类的大量信息也逐渐被揭示。本文将近年来泛酸的功能和生物合成途径中的四种酶的研究进展作了综述,以期对新型抗菌药物的研究提供理论基础。1.酸的性质和功能1.1泛酸对大鼠细胞的作用泛酸的化学式为CH2OHC(CH3)2CHOHCONH-CH2CH2COOH,由泛解酸和b-Ala组成。有旋光性,仅D型([α]=+37.5°)有生物活性。消旋泛酸具有吸湿性和静电吸附性;纯游离泛酸是一种淡黄色粘稠的油状物,具酸性,易溶于水和乙醇,不溶于苯和氯仿。泛酸在酸、碱、光及热等条件下都不稳定。泛酸几乎存在于所有的活细胞中,在原核生物、真菌、霉菌和植物的细胞内可以通过酶促反应合成。生物体还可以通过依赖Na+的多维生素转运体(SMVT,又称泛酸透酶)将泛酸转运到细胞内。泛酸是脂肪酸合成类固醇所必需的物质;也可参与类固醇紫质、褪黑激素和亚铁血红素的合成;还是体内柠檬酸循环、胆碱乙酰化、合成抗体等代谢所必需的中间物。因此,泛酸在体内可作用于正常的上皮器官如神经、肾上腺、消化道及皮肤,提高动物对病原体的抵抗力。泛酸也可以增加谷胱甘肽的生物合成从而减缓细胞凋亡和损伤。实验证明,泛酸会对遭受脂质过氧化损伤的细胞和大鼠具有很好的保护作用。泛酰巯基乙胺可以降低胆固醇和甘油三酯的浓度。泛酸及其衍生物还可以减轻抗生素等药物引起的毒副作用,参与多种营养成分的吸收和利用。2.由泛酸合成的生物合成2.1la-val生物合成的生物方法泛酸是由α-酮异戊酸和L-天冬氨酸两种物质经过四步酶促反应生成。最后在泛酸合成酶的催化下由ATP提供能量连接β-Ala和泛解酸生成泛酸(图1)。利用E.coli泛酸缺陷型菌株证明了泛酸的生物合成途径是L-Val生物合成的分支。因此如果微生物失去合成L-Val、β-Ala或半胱氨酸的能力也将无法合成泛酸。虽然细胞膜对外源性泛酸无通透性,但是在泛酸透酶的帮助下可以将细胞外的泛酸转运到细胞内,因此高等动物可以直接利用体外已有的泛酸。此外自然界中,在动物的体液或细胞液中也含有泛酸的高级同系物被称为“高泛酸”。它是由泛解酸和4-氨基丁酸生成的,4-氨基丁酸主要是在Glu脱羧酶(EC4.1.115)催化作用下由L-Glu脱羧生成。2.2pand的结构与结构(1)酮泛解酸羟甲基转移酶(EC2.1.2.11)。酮泛解酸羟甲基转移酶(PanB)是PanB基因的表达产物,催化底物α-酮异戊酸增加一个甲基形成酮泛解酸,反应过程是可逆的。在MTB和E.coli中PanB的晶体结构数据表明,酶的四级结构为十聚体,由10个相似的亚基组成,5个亚基嵌合在一起形成五聚体,2个五聚体结合成十聚体,属于(βα)8磷酸烯醇式丙酮酸超家族的成员。二级结构由8个平行的β折叠形成紧密的β圆筒状,6个α螺旋形成β圆筒的外缘,N-端有一个α螺旋叠加在圆筒的表面。酶的活性位点位于两组五聚体亚基界面的裂缝处,N-端和β5-α5环可对裂缝的形状进行修饰。酶含有两个高度保守的模序LVGDS和GIGAG,活性位点的一端含有一个Mg2+,Asp与Glu残基位于轴心,保守的Lys131,Ser63和表面的Glu199,His155氨基酸残基接近于金属中心。Glu133的羧基与His155的咪唑环堆积在一起形成带有负电荷的π电子云(图2和3)。E.coli的PanB分子量约为255kDa,等电点(pI)为4.4,米氏常数(Km)(α-酮异戊酸)为1.1×103mol/L;Km(四氢叶酸)为1.8×10-4mol/L;Km(甲醛)为5.9×10-3mol/L,最适pH在7.0到7.6之间。在37℃酶的Vmax约为8mol/min。可被后续产物泛酸(500µmol/L),酮泛解酸(50µmol/L)和CoA(>1mmol/L)反馈抑制,α-丁酸酮、丙酮酸和水杨酸酯是PanB的竞争性抑制剂。该酶在催化底物发生烯醇化反应时需要N5,N10-亚甲基四氢叶酸和二价金属离子参与,同时它们也是该酶的激活剂。(2)酮泛解酸还原酶(EC1.1.1.169)。酮泛解酸还原酶(PanE)是PanE基因的表达产物,在NADPH的帮助下将酮泛解酸还原为泛解酸。在MTB和E.coli中PanE的晶体结构数据表明,酶的四级结构是单体,并被中间的裂缝分成两部分(图4):N-端区域和C-端区域,分别由αβ折叠和8个α螺旋组成。二级结构共由12个α螺旋,3个310-螺旋和11个β折叠组成。属于6-磷酸葡萄糖脱氢酶C-端区域相似超家族成员。由于Lys176和Glu256突变后酶无活性,所以它们属于保守氨基酸。在β1和α1之间含有代表核苷酸结合位点的GCGALG序列,通过序列比对得到16个保守性氨基酸(图4),均位于裂缝附近。保守的GXGXXG序列也存在于这个区域中。E.coli的PanE分子量为33.8kDa,有303个氨基酸残基,Km(NADPH)为20µM,Km(酮泛解酸)为60µM,催化常数(kcat)为40s-1。(3)L-天冬氨酸-α-脱羧酶(EC4.1.1.11)。L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)是PanD基因的表达产物,催化脱去L-Asp的α羧基形成β-Ala。MTB和E.coli的PanD晶体结构数据表明,四级结构是由α和β两种不同的亚基组成的四聚体(图5),α-亚基靠近N-端Ser残基上共价结合丙酮酰基团,β-亚基的C-端为羟基。全酶含有三个αβ-亚基(分子量分别为11kDa和2.8kDa)和一个不完整的加工产物π-蛋白(在特异的X-Ser键处被水解的无活性的蛋白质前体,分子量约为13.8kDa)。PanD一级结构上的保守性氨基酸残基为Lys9、His11、Arg54、Thr57和Tyr58。MTB的PanD的pI为4.2,最适温度为37ºC,最适pH为7.0,Km(L-Asp)和kcat为分别为219.6µmol/L和0.65s-1。各种能与羰基反应的试剂,如NaBH4、D-环丝氨酸、肼、苯肼等对PanD均有抑制作用,其中羟胺是最有效的抑制剂;α-酮戊二酸为酶的激活剂。(4)泛酸合成酶(EC6.3.2.1)。泛酸合成酶(PanC)是paC基因的表达产物,它是泛酸生物合成途径的最后一个关键酶,催化泛解酸与β-Ala结合形成泛酸。MTB、E.coli和Thermusthrmophilus泛酸合成酶晶体结构数据表明,酶是以同型二聚体形式存在的。SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得亚基的分子量约为33kDa。E.coli泛酸合成酶的pI为4.6,最适pH值为10.0,最适温度为30ºC。K+,NH4+和Mg2+可作为激活剂。一些ω-氨基酸有强烈的抑制作用,酶也可以被螯合剂抑制,丁酸钠对其有弱的抑制。表观Km(泛解酸)为63µmol/L,Km(β-Ala)为150µmol/L,Km(ATP)为100µmol/L,kcat为3.4s-1。酶反应动力学机制为“乒乓机制”,分两步反应进行。在植物拟南芥中的泛酸合成酶还可以发生变构效应,这种变构效应在不改变活性位点的情况下实现功能适应性。PanC的四级结构为蝴蝶状(图6),每个亚基都含有两个非常容易被区分的区域,活性中心的洞穴是由N-端区域的186个氨基酸残基形成的Rossmann折叠组成,被C-端区域铰链结构覆盖。在与底物结合时,His47或Lys160决定着酶对ATP的亲和力;His44、His47、Asn69、Gln72、Lys160对稳定反应中间体泛酰腺苷酸发挥着重要作用。MTB和E.coli的泛酸合成酶三维结构N-端区域在结构上与I类氨酰tRNA合成酶相似,属于胞苷酰转移酶超家族成员。发生反应时首先在活性中心形成泛酰腺苷酸,随后结合β-丙氨酸,活性中心位点可容纳体积较大的AMPCPP,这表明不反应的泛酰腺苷酸类似物很可能是PanC的高亲和性和高特异性的抑制剂。3.泛酸生物合成途径抑制剂的筛选和抗结构优化泛酸在生物体中发挥着许多重要的功能,泛酸合成途径中的四种酶的主要特征已经得到确证(表1)。泛酸可以直接影响细菌的生长,也会影响到一些病原菌的致病能力。这种影响作用在MTB中已经得到证实,将PanCD基因双敲除后得到的MTB毒性比卡介苗还低。Rubin已经证明是PanC基因对结核分支杆菌的生存至关重要。PanCD基因突变的MTB即使再提供外源性泛酸也无法恢复MTB的致病性。由于泛酸合成途径在高等动物中不存在,决定了从这个生物合成途径中寻找抗菌药物靶点是可行的。通过对恶臭假单胞菌、超嗜热菌、百脉根根瘤菌、乳酸乳球菌、大肠杆菌、副百日咳杆菌、致病性结核杆菌、问号状钩端螺旋体和酿酒酵母等菌泛酸合成途径中的四个酶的氨基酸序列比对发现在微生物中它们的保守序列同源性较大,因此,推断针对泛酸合成途径酶类为靶点进行的抗菌药物研究很可能获得的是广谱抗生素类药物。基因组学和蛋白质组学等分子生物学技术的发展促进了泛酸合成途径中的各种酶结构和理化性质的研究,在此基础上于2005年剑桥大学化学实验室Ciulli和Abell等开创立应用生物物理学的方法将PanB、PanE和PanC作为靶酶进行药物抑制剂设计的研究;Chopra和Kwon等将PanD作为病源微生物如MTB和幽门螺杆菌的药物作用的靶点的研究也在进行中;在2007年,Lucile和Kristen等运用多级酶促反应对化合物库进行PanC抑制剂筛选研究得到了有抑制作用的草酸萘呋胺酯,对它的抗菌活性的进行了研究;中国医学科学院医药生物技术研究所新药筛选重点实验室首次在国内建立起以泛酸合成酶为靶点的抗结核药物筛选模型,并应用该模型从微生物的次级代谢产物寻找PanC抑制剂的研究已经完全展开。期望在不久的将来,针对泛酸生物合成途径的研究获