基于荧光标记-多重pcr技术的中国部分牛品种遗传多样性分析

基于荧光标记-多重pcr技术的中国部分牛品种遗传多样性分析

在中国，除了公牛和水牛，还有混合科的牛。中国黄牛是我国固有的、曾经长期以役用为主的黄牛群体的总称,具有肉品质优良、耐粗饲、抗逆性强及遗传有害性状频率相对较低等优点,是世界家牛属遗传资源宝库中一个风貌独特的组成部分。中国黄牛有28个地方品种,另外,还存在其他一些地方类群(或品种),是世界上牛品种最多的国家。近年来,由于外来品种的引进及养牛的经济效益逐渐下降等原因,我国原有地方品种资源日趋减少,邓川牛、塘脚牛和冀南牛等品种已经消亡,舟山牛、复州牛和平陆山地牛等也面临灭绝的危险。因此,对国内黄牛品种资源进行调查、研究、保护及合理利用已是一项刻不容缓的工作。微卫星DNA标记作为一种成熟的分子标记方法,已被广泛的应用在牛品种的遗传资源研究和保护上。Rendo、Moazami-Goudarzi、MacHugh、Edwards等分别利用微卫星标记对国外不同品种的牛进行了遗传结构的分析;马月辉、曹红鹤和常洪等也分别利用微卫星标记对中外牛品种的遗传结构进行了分析。本文选用联合国粮农组织(FAO)推荐的12对微卫星引物,对12个中外牛品种的遗传多样性进行了研究。1材料和方法1.1品种丰富及典型特征本研究中12个中外牛品种血样的采集地及采集数量见表1,其中德国黄牛、西门塔尔牛和夏洛来牛是我国引进黄牛品种。每个牛品种随机采集约60头,其中公牛不少于10头。要求采样个体具备品种的典型特征,并且在3代或2代内没有血缘关系。采用前腔静脉采血,每头牛采血量10mL。新鲜血液用1:1的裂解液(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,2%SDS)裂解,常温下即可运输,-20℃长期保存。1.2实验方法1.2.1电泳检测试剂血液DNA提取采用常规酚-氯仿抽提法,见参考文献。Taq酶、10×buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司,dNTPs购自上海生工生物工程技术服务有限公司,POP4胶、甲酰胺等电泳检测试剂均使用美国应用生物系统公司进口试剂。提取出的基因组DNA首先经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测合格,然后用生物分光光度计将其浓度调整为20～50ng/µL后即可进行PCR扩增。1.2.2pcr扩增条件2+浓度、复性温度、循环次数进行优化,取得最佳的扩增效果。扩增反应体系为15µL,内含:20～50ng模板DNA,0.15～0.30pmol/µL的引物,1U的Taq酶,0.3mmol/L的dNTPs,1～1.5mmol/L的MgCl2和1×PCRbuffer。PCR扩增条件为:95℃5min;95℃1min,51～60.5℃1min,72℃1min,30～35个循环,72℃40minㄢ1.2.3微卫星基因型检测PCR产物扩增成功后,采用ABI3100-Avant全自动基因分析仪进行检测,微卫星基因型用仪器自带软件GeneMapperVersion3.2进行分析。1.2.4公式动力编编制程序采用GENEPOPVersion3.4计算等位基因频率。多态信息含量(polymorphisminformationcontent,PIC)根据Botstein等的公式自编程序计算。用DISPAN软件包计算Nei’s标准遗传距离(Nei’sstandardgeneticdistance,DS)和Nei’s遗传距离(Nei’sgeneticdistance,DA)。采用非加权组对算术平均法(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmean,UPGMA)和邻近结合法(neighbor-joiningmethod,NJ)进行聚类分析,利用BootstrapTest检验所得聚类结果的可靠性。2结果2.1微卫星座位的等位基因计数在同一微卫星座位上等位基因数目和频率的差异可以反映出家畜品种内和品种间的差异。12个微卫星座位中,TGLA122座位的等位基因数最多,达到25个;BM1824和ILSTS054座位的等位基因数最少,只有10个;其余座位的等位基因数在11～22个之间。各微卫星座位的等位基因数和多态信息含量见表2ㄢ2.2群体的遗传变化2.2.1个中国地方牛品种的等位基因特有等位基因是指品种在所研究的座位上特有,而其他品种没有的等位基因。9个中国地方牛品种中除了长白地方牛、早胜牛和平陆山地牛外,都至少拥有一个特有等位基因。其中黎平牛最多,达到6个。3个外来品种各有一个特有等位基因。各品种拥有的特有等位基因频率都较低,在0.01～0.07之间(表3)。2.2.2位位基因信息优势等位基因是指品种在特定的基因座位上相对集中的等位基因,表4列出了基因频率大于0.4的优势等位基因。12个微卫星位点中,除了HEL5和TGLA122外,其他位点至少有一个优势等位基因,BM1824位点最多,达到4个。12个中外牛品种的优势等位基因主要集中在HEL13、TGLA126、TGLA53等位点上,其中,延边牛和德国黄牛各拥有6个优势等位基因,其他品种拥有1～5个优势等位基因。夏洛来牛在TGLA126位点上拥有116bp的优势等位基因(P=0.80)。2.2.3各等位基因都是出现突变共有等位基因可能是物种基因组中最为古老、保守的等位基因,其余等位基因则是在进化过程中由于插入、缺失等突变机制造成的。12个品种在12个微卫星座位上包含69个共有等位基因,详见表5ㄢ2.2.4微卫星座上的等位基因信息12个牛品种的等位基因数、多态信息含量、平均遗传杂合度见表6。12个品种在所研究的12个微卫星座位上共拥有179个等位基因。郏县红牛的平均等位基因数最多(10.58),其他地方品种牛都在8.4个以上,3个引进品种的等位基因数较少(7～7.8)。在3项指标中,郏县红牛最高,德国黄牛最低,而且地方品种牛普遍高于引进品种牛。2.3牛间的遗传距离分析12个牛品种间的Nei’s遗传距离(DA)和Nei’s标准遗传距离(DS)见表7。恩施牛、黎平牛、昭通牛、川南山地黄牛两两之间的遗产距离很小(DA=0.0509∼0.0781,DS=0.0192∼0.0740);郏县红牛、早胜牛、平陆山地牛之间的遗产距离也很小(DA=0.0580∼0.0689,DS=0.0347∼0.0453);延边牛和长白地方牛之间的DA=0.0503,DS=0.0361。西门塔尔牛、夏洛来牛和德国黄牛与中国地方品种牛之间的遗传距离都很大(DA=0.1671∼0.3296,DS=0.2121～1.0203),而相互之间的遗传距离却相对较小(DA=0.1109∼0.1870,DS=0.1236～0.2443)。采用Nei’s遗传距离(DA)进行UPGMA和NJ聚类分析,(图1,图2)。两图在延边牛和长白地方牛聚为一类后,再与哪一些品种首先聚类的问题上产生了差异,图1是与当地品种首先聚为一类,而图2是与3个外来品种首先聚为一类。产生差异的原因可能是两种聚类方法的假设条件不同引起的。根据邱怀等中国黄牛的分类情况,本研究将UPGMA/DA聚类图作为本研究的首选聚类图(图1)。恩施牛、黎平牛、昭通牛和川南山地牛属于南方黄牛,聚为一类郏县红牛、早胜牛和平陆山地牛属于中原黄牛,聚为第2类;延边牛和长白地方牛属于北方黄牛,聚为第3类;3个外来品种聚为第4类。3讨论3.1牛品种的遗传多样性多态信息含量(PIC)是衡量标记多态性较好的指标。Botstein等提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标:当PIC>0.5时，为高度多态位点;当0.25<PIC<0.5时,为中度多态性位点PIC<0.25时,为低度多态位点。研究结果表明,本实验所选的12个微卫星全部为高度多态位点,可作为有效的遗传标记用于牛品种间遗传多样性分析。遗传杂合度是度量群体遗传变异的一个较合适的参数。本研究结果表明:9个地方品种牛的平均遗传杂合度都较高(0.712～0.827),说明大部分所研究的中国地方黄牛的遗传多样性较高。其中延边牛和长白地方牛较低,说明这两个群体中存在一定程度的选择和近交。马月辉等用微卫星研究部分黄牛品种遗传多样性时发现:延边牛的观测多样性明显低于期望的多样性,存在选择和近交,与本研究结果一致。3个外来品种的平均遗传杂合度相对较低(0.661～0.696),推测这3个品种经过高度专门化选育后已造成部分遗传多样性丢失,从而使群体结构比较单一,同质性较高。这与罗永发的研究结果相一致。3.2不同种类牛品种的聚类分析Takahashi等和Nei等通过计算机模拟对各种遗传距离进行研究,证明在分析物种内群体间的遗传变异时,运用DA和DS遗传距离是获得准确系统发生树的最有效方法,且用UPGMA法优于NJ法。陈红菊等认为在用微卫星标记分析品种的传多样性时,运用遗传距离的UPGMA聚类法比其他方法更可靠。本研究采用NJ/DA和UPGMA/DA分别作图,UPGMA/DA能够清晰的将中国地方黄牛聚为3类,因此被选为首选聚类图,与以上结论相吻合。《中国牛品种志》一书认为,中国牛起源于普通牛和瘤牛。中国黄牛按地理分布区域和生态条件划分为中原黄牛、北方黄牛和南方黄牛3大类型。陈幼春用6个多态蛋白位点对20个牛种进行遗传检测发现:中国北方牛和南方牛的品种内均质度较好,杂合度较低,而中原地区牛种的品种内杂合度较高。本研究中,9个中国地方黄牛被聚类为3类,分别属于南方黄牛(H=0.750-0.798)、中原黄牛(H=0.807-0.827)和北方黄牛(H=0.712-0.737),与上述结论一致。于汝梁等究中国黄牛Y染色体多态性时发现,北方黄牛具有普通牛核型(含中或亚中着丝点Y染色体),南方黄牛具有瘤牛核型(含近端着丝点Y染色体),而中原黄牛介于两者之间(含中或亚中着丝点Y染色体和近端着丝点Y染色体)。陈宏等在研究中国黄牛性染色体多态性时发现,中国黄牛在形成过程中,南方牛受瘤牛的影响大,北方牛受普通牛的影响大,而中原牛既受到普通牛的影响又受到瘤牛的影响。本研究中,聚为一类的郏县红牛、平陆山地牛和早胜牛都属于中原黄牛,也许正是因为融合了普通牛和瘤牛的血液,使得它们的平均等位基因数、多态信息含量、遗传杂合度比其他两个类群都高(表7)。郏县红牛更是在所研究的9个中国地方黄牛中3项指标都最高,这可能与其在长期的选育中不断引入外血有关系。延边牛与长白地方牛聚为一类,而且两者之间的DA遗传距离最小(0.0503),见表6。在《中国牛品种志》中,将吉林的延边牛、长白地方牛、辽宁的沿江牛和黑龙江的朝鲜牛(本研究未涉及)合并称为延边牛,本研究支持该观点。罗永发等用微卫星标记分析13个中外牛品种的遗传结构时,也得出了相同的结论。在本研究的UPGMA/DA聚类图(图1)中,郏县红牛、平陆山地牛和早胜牛聚为一类后,首先与聚为一类的南方4个品种聚类,然后又与北方黄牛聚类。这说明本文所研究的几个中原黄牛品种受瘤牛的影响比受普通牛的影响要大。王毓英等在研究中国部分黄牛血液蛋白多态性时将9个地方品种聚为3类,中间型(晋南、平陆、郏县、峨边和南阳牛)首先与南方组(海南牛和温岭高峰牛)聚类,然后与北方组(延边牛和蒙古牛)。于汝梁在研究中国黄牛Y染色体多态性时发现,黄河和淮河之间的南阳牛和鲁西牛虽属于中原黄牛,但他们具有瘤牛核型,是以瘤牛为基础形成的黄牛品种。以上研究结果与本文相符。但雷初朝