一测多评法测定姜药材中4种姜酚类成分的含量

一测多评法测定姜药材中4种姜酚类成分的含量

生姜是姜科植物的干燥根系。它具有加热和散寒、回阳通脉、除湿和去粘液的功效。干姜的活性成分主要是姜酚类,包括6-姜辣素、8-姜辣素、10-姜辣素、12-姜酚等10余种成分。关于干姜的质量控制,2010年版《中国药典》仅以6-姜辣素作为质量控制指标,不能全面反映干姜药材及饮片的内在品质。文献报道也有以6-姜辣素、8-姜辣素及10-姜辣素为指标的多成分含量测定。但由于姜辣素类成分不稳定,很容易被氧化成姜烯酚、姜酮及相应的醛类成分,限制了这一方法的广泛应用。本文引入一测多评法对干姜进行多指标的质量控制,以6-姜辣素为内参物,通过建立其与8-姜辣素、10-姜辣素及6-姜酚间的相对校正因子进行含量计算,探讨一测多评法在干姜药材质量评价中应用的可行性。1材料表面1.1超声清洗仪测试Agilent1120高效液相色谱仪,Waters2695高效液相色谱仪,色谱柱UltimateTMXB-C18(4.6mm×250mm,5μm),SepaxSapphire-C18(4.6mm×250mm,5μm),DS-8510型超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司)。1.2姜科植物姜干姜药材购自广州市药材公司中药饮片厂,经广东药学院中药学院程轩轩博士讲师鉴定为姜科植物姜Zingiberofficinale(willd)Rosc.的干燥根茎。1.3生物科技研究6-姜辣素(批号23513-14-6)购自北京金宝在线科技有限公司、10-姜辣素(批号P0131)、6-姜酚(批号P0621)购自上海纯优生物科技有限公司,8-姜辣素(批号FY13430828)购自南通飞宇生物科技有限公司。实验所用试剂甲醇、乙腈为色谱纯,屈臣氏蒸馏水。2方法和结果2.1方法研究2.1.1流动相乙腈-1.1%磷酸水UltimateTMXB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B),洗脱梯度(0~20min,60%~75%A,20~45min,70%~85%A),检测波长280nm,流速0.6mL·min-1,柱温30℃。上述色谱条件下,各组分分离度良好,结果见图1。2.1.2对照品溶液的配制分别取6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素对照品适量,精密称定,甲醇溶解,配置成质量浓度分别为10.01,4.00,4.49,2.19g·L-1的对照品溶液。分别精密移取上述4个对照品溶液24,25,50,100μL置于1mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,即得混和对照品溶液,于4℃保存备用。2.1.3试验溶液的制备2.1.4进样分析精密吸取上述混合对照品溶液0.5,1,2.5,5,7.5,10,15μL进样分析,每个浓度进样2次。以进样量对峰面积积分值进行回归,6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素的标准曲线见表1。2.1.5采用回归因子计算以6-姜辣素为内标,按公式分别计算6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素对6-姜辣素的校正因子,结果见表2。2.1.6精密度试验,各节点点精密度试验,最终达到6-姜辣素的添加量2.精密吸取同一供试品溶液10μL连续进样6次,记录峰面积,6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素的精密度分别为0.35%,1.01%,0.48%,0.13%。2.1.7样品稳定性分析精密吸取同一供试品溶液10μL分别于配后的0,2,4,8,12,24,48h进样分析记录峰面积,6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素稳定性的RSD分别为0.64%,1.01%,0.92%,0.49%,表明处理后的样品在48h内稳定。2.1.8平均质量分数称取干姜药材粉末约0.5g共6份,精密称定,按供试品溶液处理方法制备样品,测定,结果6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素的平均质量分数分别为8.97,1.26,2.61,4.03mg·g-1,RSD分别为0.87%,1.16%,0.53%,0.22%。2.1.9标准回归率2.2修正因素的重复回归2.2.1不同的设备和色谱柱的研究2.2.2相对校正因子在经两个实验室进行试验UltimateTMXB-C18(4.6mm×250mm,5μm),不同实验室所得的相对校正因子差异较小,RSD在1.12%~2.86%。2.3测定指标的相对保留值知道6-姜辣素的保留时间,利用待测成分对于6-姜辣素的保留时间及相对保留值,即可对峰进行定位,考察以上2个参数在不同仪器和不同规格色谱柱中的重复性,保留时间波动的RSD在2.42%~2.63%,见表4。各待测成分的相对保留值波动较小,RSD在0.53%~0.79%,见表5。因此认为选相对保留值作为干姜中上述待测成分的定位指标。在一测多评法的实际应用中可参考药材典型色谱图,利用相对保留值定位,并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征,能正确判断待测成分峰的位置。2.4小产品中生姜成分测定取28批干姜药材粉末约0.5g,精密称定,按2.1.3项下操作,制成供试品溶液。分别精密吸取不同批次药材供试品溶液及对照品溶液进样分析测定。采用外标法和一测多评法分别计算干姜药材中6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素和10-姜辣素的含量,结果见表6。表明两种含量测定方法得到的含量值之间无显著性差异,一测多评法可用于干姜药材的多成分质量评价研究。3测定引导文献中各相对校正因子的含量在查阅文献、借鉴前人研究结果的基础上,本实验分别考察了甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯提取溶剂,超声、回流、浸泡等不同提取方法,结果以甲醇作为溶剂,超声提取,目标成分提取率较高,分离度较好,干扰的杂质峰较少,且方法简单,成本较低。比较了甲醇-水、乙腈-水,加入磷酸等流动相系统,结果发现乙腈-0.1%磷酸水的分离度较好,干扰的杂质峰较少。6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素是干姜中的主要特征性成分,含量较高,药理活性显著且与干姜的功能主治相关,是公认评价干姜质量的适宜指标性成分。因6-姜辣素对照品价廉易得,故本实验选用6-姜辣素为内参物,建立干姜中4个成分的一测多评法。一测多评所得成分含量的计算值与传统的外标法所得实测值间没有显著性差异,说明一测多评法可以应用于干姜药材多成分的含量测定。取干姜药材粉末(过80目筛)0.5g,精密称定,置于50mL带塞锥形瓶,精密加入20mL甲醇,称定,超声40min,放冷,再称定质量,补足质量,摇匀,用滤膜(0.22μm)滤过,取续滤液即得。称取干姜药材粉末约0.25g共9份,精密称定,分别按已知质量分数的50%,100%,150%3个水平加入6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素对照品,按2.1.3项下操作,在上述色谱条件下进样测定,计算加样回收率,6-姜辣素、6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素的加样回收率分别为102.5%,101.3%,103.3%,102.7%,RSD分别为1.5%,2.79%,1.44%,1.89%。精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液1,2.5,5,7.5,10μL,进样分析,每个质量浓度进样3次,取平均值。分别计算6-姜酚、8-姜辣素、10-姜辣素对6-姜辣素的校正因子。试验分别考察了Agile