中草药抗菌活性的研究

中草药抗菌活性的研究

食品腐败和变质主要是由有害微生物引起的。目前食品防腐保鲜采用的主要是化学合成试剂,如苯甲酸、山梨酸及其盐类等,但有研究表明有些化学合成的食品防腐剂具有致癌、致畸,致突变等毒副作用。随着消费者对食品质量的日益重视,寻求能够替代化学防腐剂的天然食品防腐剂,成为了食品科学研究和应用的一个热点,对天然植物的抗菌活性的研究也取得了一些进展。本实验选取了常用于临床抗菌的十味植物源中草药,并以六株食品中常见污染菌为供试菌,进行体外抗菌试验,从而为天然植物防腐剂开发和应用提供理论。1材料和方法1.1材料表面1.1.1中药样品十味中草药样品均购于北京市前门同仁堂药店,各中草药样品的名称、产地、所用部位及提取方法详见表1。1.1.2供试菌株及菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)AS1.89、大肠杆菌(Escherichiacoli)AS1.90、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)AS1.1849、啤酒酵母(Saccharomycete)AS2.430、黄曲霉(Aspergillusflavus)AS3.3800及绿色木霉(Trichoderma)3.3711,以上六种供试菌均购于中科院微生物所。1.1.3仪器旋转蒸发器RE-52上海亚荣生化仪器厂;高压灭菌釜MLS-3750日本三洋公司;LRH-250生化培养箱上海一恒科技有限公司。1.1.4试剂乙醇(分析纯);无菌生理盐水依据国标(GB)配制。1.2方法1.2.1水煎水溶液的制备取粉碎后的中草药100g于1000ml蒸馏水中,室温浸泡30min后煮沸10min,稍加冷却后过滤得到水煎液;剩余药渣中加入500ml蒸馏水煮沸10min,重复两次;合并两次水煎液,减压蒸馏浓缩至100ml,经121℃灭菌25min后,于4℃冰箱内保存备用,此为100%的水煎药液。100%药液浓度定义为1g原料提取液浓缩至1ml的浓度。1.2.2%乙醇提取水溶液取粉碎后的中草药50g于500ml的70%乙醇水溶液中,加热回流3h,稍加冷却后过滤得到粗提取液;通过减压蒸馏去除其中的乙醇,使其浓缩至100ml,经121℃灭菌25min后,于4℃冰箱内保存备用,此为1/2的70%乙醇提取药液。空白样液除用50ml蒸馏水代替中草药外,其余同上。1.2.3菌种活化和活化将各细菌实验菌种分别接种于若干营养琼脂斜面上,于37℃培养24h;将酵母菌和霉菌实验菌种分别接种于若干PDA斜面上,于30℃培养72h,进行菌种活化。活化后的细菌和酵母,做十倍系列稀释,并活菌计数。活化后的霉菌直接移入适量无菌生理盐水中,充分振荡,制成供试菌液。1.2.4菌种和真菌培养用无菌蒸馏水对药液进行一系列二倍稀释,得到十个系列浓度的药液(1(原液)、l/2、1/4、l/8、l/16、l/32、1/64、1/128、l/256);将药液与琼脂培养基按1:10均匀混合,制成平板,取适量供试菌液进行涂布接种(霉菌采用点接种);细菌于37℃培养24h,真菌于30℃培养72h。以上药液的浓度均为体积比(V/V)浓度。2结果与讨论2.1对细菌的活性十味中草药对真菌的抗菌活性:其浓度为1/10时对黄曲霉均未表现出抗菌活性,只有黄柏和黄芩在浓度为1/20时对啤酒酵母和绿色木霉有抗菌活性,厚朴在浓度为1/40时对啤酒酵母有抗菌活性。十味中草药对细菌的抗菌活性:抗金黄色葡萄球菌活性>抗枯草芽孢杆菌活性>抗大肠杆菌活性。除川芎外的九种中草药表现出一定抗金黄色葡萄球菌活性,其中黄连和黄芩在浓度小于1/640时仍有活性;对枯草芽孢杆菌,只有川芎和金银花浓度为1/10时未表现出抗菌活性,而黄连在浓度为1/640时仍有活性;对大肠杆菌,只有黄芩、连翘、厚朴、艾叶和五味子在浓度为1/10到1/80之间时有抗菌活性。黄芩对黄曲霉外的其它供试菌均表现出一定抗菌活性,并在浓度为1/640时表现出抗金黄色葡萄球菌活性。黄柏浓度为1/10时对大肠杆菌和黄曲霉未表现出抗菌活性。厚朴浓度为1/10时对黄曲霉和绿色木霉未表现出抗菌活性。黄连在浓度为1/1280时仍对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性,但对大肠杆菌未表现出活性。连翘、艾叶和五味子浓度为1/10时对酵母和霉菌未表现出抗菌活性,对供试细菌均有抗菌活性。甘草在浓度为1/20时对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性,金银花在浓度为1/80时对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,其浓度为1/10时对其它供试菌无抗菌活性。川芎原液对所有供试菌均无抗菌活性。2.2空白对照处理采用70%乙醇对黄芩进行提取,并对提取液进行体外抗菌实验,同时以水和70%乙醇溶液分别做空白对照。表3中详细列出了黄芩水煎液和70%乙醇提取液的抗菌效力和最小抗菌浓度,所做空白对所有供试菌均无抗菌活性。2.3菌种抗菌活性由图1可知,黄芩水煎液和70%乙醇提取液对其中五种供试菌均表现出抗菌活性。两种样液对金黄色葡萄球菌表现出了相同的抗菌活性,最小抗菌浓度为1/640;对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和绿色木霉也有不同程度的抗菌活性,70%乙醇提取液抗菌效力明显大于水煎液,尤其是对枯草芽孢杆菌,70%乙醇提取液最小抗菌浓度为1/360,而水煎液最小抗菌浓度为1/20;但两种药液对黄曲霉无抗菌作用。2.4抑菌圈边界不明显体外抗菌试验包括连续稀释试验和扩散试验,扩散试验加药量少、抑菌圈界限不明显,导致结果不易准确记录;连续稀释法简单、快速并且易于观察结果,适宜于对抗菌活性好的中草药进行初步筛选,因此,本实验采用连续稀释法作为体外抗菌试验方法。3乙醇提取液的抗菌活性测定十味中草药水煎液的抗细菌活性大于抗真菌活性。其抗细菌活性又表现为对革兰氏阳性菌的抗菌活性高于革兰氏阴性菌;其抗酵母活性大于抗霉菌活性,并且对黄曲霉均未表现出抗菌活性。黄芩、黄柏和黄连表现出的抗菌活性相对较强,其中黄芩抗菌活性好、抗菌谱宽;黄连对部分供试菌有较强抗菌活性,但其抗菌范围较窄。连翘、厚朴、艾叶和五味子表现出的抗菌活性次之。甘草、川芎和金银花抗菌活性较差,其中川芎对所有供试菌无抗菌活性。实验表明,70%乙醇提取液的抗菌活性高于水煎液,这是由于乙醇将中草药中的一些具有强抗菌活性成分提取出来,从而使醇提液表现出了较强的抗菌活性。对乙醇提取液中抗菌有效成分及其相互作用的研究将是下一步研究的重点,这将为植物源天然