太平洋牡蛎酶解过程中挥发性风味物质的变化

太平洋牡蛎酶解过程中挥发性风味物质的变化

牡蛎是世界上最重要的养殖种类，也是中国四大主要养殖种类之一。2010年世界牡蛎年产量为459万t。而太平洋牡蛎(Crassostreagigas)因其产量高、效益好近几年来受到广泛的关注。近年来,应用蛋白酶酶解牡蛎制备水解产物受到广泛关注。牡蛎经过酶解后,不仅其营养物质更容易被人体吸收并且还具有降血压和抗氧化等多种生理功能。但是牡蛎本身所具有的腥味以及酶解过程中产生的异味严重影响了牡蛎酶解物的应用。研究表明,造成牡蛎酶解液不良风味的主要原因是酶解过程中牡蛎脂质的氧化降解以及蛋白质降解。牡蛎经过均质处理后,其肌肉组织受到机械损伤,不饱和脂肪酸暴露在空气中,经过蛋白酶酶解的作用,其质构不断变松散,导致脂肪与空气中的氧气接触面积增大,加剧了氧化裂解。同时,蛋白质酶解产物氨基酸又同脂肪氧化产物共存,加强了酸败作用,引起牡蛎酶解液色、香、味的不断恶化。Yarnpakdee等在罗非鱼酶解过程中加入复合抗氧化剂(水溶性维生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,Trolox)和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)),得到风味良好的酶解液。生姜是传统中药材和香辛调味料,其提取物具有抗氧化、降血糖等多种生理活性。姜中另一有效成分——姜精油,不仅可以贡献出愉快的风味,还可以掩盖不良风味。黄冬香等曾报道用鲜姜汁酶解罗非鱼肉,得到风味良好的鱼肉酶解液。但是用生姜改善牡蛎酶解过程中的风味还未见报道。刘慧、叶盛权等利用活性碳、β-环糊精、酵母发酵等多种方法对牡蛎酶解液进行风味改善,但是这些方法会导致营养物质的部分损失。此外,目前关于牡蛎在酶解过程中异味产生的机理及改善方法的研究报道也比较少。因此,本实验利用感官、化学指标以及气相色谱-质谱联用技术探讨牡蛎酶解过程中挥发性成分变化的情况,在此基础上探究姜汁对牡蛎酶解过程中脂肪氧化的抑制作用以及对牡蛎酶解液的风味改善作用。从而为改善牡蛎酶解液风味以及研发优质牡蛎制品提供一定的理论基础和实验数据。1材料和方法1.1蛋白质和氨基酸太平洋牡蛎购于青岛南山市场,软体组织平均质量(15±5)g;生姜产于山东潍坊。碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L(90U/mg)、胰蛋白酶(100U/mg)、风味蛋白酶(15U/mg)丹麦诺维信公司;丙二醛、甘氨酸、VE标准品美国西格玛公司。其他化学试剂均为分析纯。1.2u3000仪器DS-1高速组织捣碎机上海标本模型厂;7230型分光光度计上海精密科学仪器有限公司;GL-G-Ⅱ立式冷冻离心机上海安亭科学仪器厂;DF-101S恒温加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司;GC6890-5973MSD气相色谱-质谱仪(gaschromatographmassspectrometer,GC-MS)美国安捷伦公司;SPME萃取头(30~50μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzenecoating,PDMS/DVB)美国Supelco公司。1.3方法1.3.1蛋白质添加量选择牡蛎肉洗净后打浆,固定料液比为1∶3(m/V),酸碱调节pH值至7.2,每克蛋白质分别添加1500UAlcalase2.4L、胰蛋白酶、风味蛋白酶(3种酶活力比为2∶1∶1),55℃酶解2h后置于沸水中灭酶10min。于5000r/min离心10min后取上清液。1.3.2牡蛎匀浆酶解结果生姜洗净后切块,添加质量分数为50%的水打浆。过滤后取滤液待用。酶解之前加入质量分数为2%的滤液于牡蛎匀浆中与其一起酶解。本实验姜汁中姜辣素含量为13.57mg/mL,总酚含量为73mg/100mL。DPPH自由基清除力为2.64mmol/LTrolox,还原力为5.03mmol/LTrolox。1.3.3快速测定方法测定总成分配的吸光度取1mL样品与1mL茚三酮溶液(含质量分数为0.5%茚三酮与0.3%D-果糖)混合后置于沸水中加热10min,再加入5mL95%的乙醇,混匀后于570nm波长处测定其吸光度,同时以甘氨酸做标准曲线。1.3.4测定硫代比妥酸thiobalbitoriccacsubhance，nbs的值参照Srinivasan等的方法。1.3.5感官评价学习将30g样品装在100mL锥形瓶中,密封平衡30min。10个感官评定员(5男5女),23~25岁之间,系统学习过感官评定课程,有丰富的感官评定经验。采用0~10分制评定气味强度,0分最弱,10分为最强,最后得分取平均值。在训练阶段,感官评定员在嗅闻样品后经过讨论,决定使用与牡蛎风味相关的感官描述词汇。1.3.6gc-ms分析条件顶空固相微萃取(solidphasemicro-extraction,SPME)条件:将8mL样品装在SPME专用瓶中,60℃萃取30min。萃取结束后立即将萃取针插入进样口(250℃)中解析4min。萃取头在首次使用时需250℃老化1h。色谱条件:HP-5毛细管色谱柱(5%苯基,95%聚二甲基硅氧烷):(30m×0.32mm,0.25μm);载气为高纯氦气(99.999%),流速1.0mL/min;不分流进样,进样口温度:250℃;柱温:初温40℃恒温3min,以6℃/min的速率升至200℃,再以10℃/min升至250℃,保持10min。质谱条件:电离源为EI,离子阱温度150℃,GC-MS传输线温度250℃,质量扫描范围33~300,EI电子能量为70eV。利用AgilentG1701MSDProductivityChemStation增强型数据分析工作站NIST05aLibraries标准谱库自动检索各组分质谱数据,选择匹配度大于80(满分100)作为鉴定结果。用峰面积归一化法确定物质的相对含量。1.3.7牡蛎酶解液对样品风味的贡献某一种物质是否对风味产生很大影响不仅要看其浓度还要分析其阈值,即挥发性化合物对于样品总体风味的贡献由其在风味体系中质量浓度和阔值共同决定的。因此,本实验通过计算化合物的相对气味活度值(ralativeodouractivevalue,ROAV)的方法来评价该物质对样品总体风味的贡献。计算见下式。式中:Cri、Ti分别是各化合物的相对含量和相应的感觉阈值;Cmax、Tmax是对总体风味贡献最大的组分相对含量和相应的感觉阈值。所有的组分均满足0<ROAVi<100,且ROAVi值越大的组分对样品总体风味的贡献越大。ROAV>1的风味化合物认为是所分析样品的主体风味成分。由图1可知,经过感官人员的评定,与新鲜牡蛎相比,牡蛎酶解液腥味、哈喇味显著增加;青草味显著减弱(P<0.01);果香味在酶解前后变化不显著(P>0.05)。这说明牡蛎经过酶解后风味变差。冯金晓等研究发现,牡蛎酶解液随酶解时间的延长,腥味变重,风味变差。2.1.2牡蛎液的风味成分酶解前后的挥发性气体成分如表1所示,经过GC-MS以及NIST质谱数据库检索分析,酶解前的牡蛎液有35种挥发性物质,酶解后牡蛎液有42种。主要包含醛类、酮类、醇类、酯类、烃类、酸类以及杂环类等物质。为了更方便的分析挥发性气体成分的变化,计算检测到的每种挥发性物质的ROAV值,并将ROAV值>1的物质按照从大到小的顺序进行排列(表2),新鲜牡蛎液的主体风味成分主要有:1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛、2-乙基呋喃、2,3-辛二酮、辛醛等。主要呈现出青草味、黄瓜味、腥味以及蘑菇味。这与顾聆琳、刘慧等研究新鲜牡蛎肉的挥发性成分大致相同,但是刘辉等对新鲜牡蛎肌肉中的挥发性物质进行分析的结果表明,1-庚烯-3-醇、绿叶醇、肉豆蔻酸等化合物含量比较丰富,这与本研究结果略有不同。分析原因可能是原料来源、品种以及储存的方式不同。酶解后牡蛎液的主体风味成分为:2-壬烯醛、异戊醛、二甲基硫醚、1-辛烯-3-醇、辛醛、壬醛、2-乙基呋喃等。主要呈现出油脂氧化的哈喇味、腥味、贝肉香以及蘑菇香气等,这也与感官评定结果一致。而邓焉容等认为吡嗪类、芳香醇类以及羟基呋喃等物质是牡蛎酶解液的主要风味组成成分。这可能是由于原料的差异或者是酶的种类以及酶解条件不同。醛类是对酶解前后牡蛎风味影响最大的物质,醛类的阈值很低,很低的浓度即可产生很浓的风味,对牡蛎液的风味影响显著。酶解前醛类物质相对含量为23.54%,酶解后增加到36.9%,其中,2-壬烯醛的风味特征为肉香、蘑菇香,酶解后含量增大,是影响酶解后牡蛎液风味最大的成分。酶解前后牡蛎液的主体风味成分中都含有辛醛、壬醛、庚醛、戊醛,相对含量分别从酶解前的0.8%、0.98%、1.64%、3.4%,增加到酶解后的2.5%、1.6%、2.3%、6.8%。这些直链饱和醛、烯醛和二烯醛是亚油酸酯和亚麻酸酯氢过氧化物的降解产物,是各种氧化、刺激风味的主要来源,造成酶解液中不良风味的产生。一般饱和醇类物质的阈值很高,对气味的贡献不显著,而不饱和醇则有较低的阈值。醇类物质含量由酶解前的19.43%下降到酶解后的13.41%,主要醇类为1-辛烯-3-醇,对酶解前的气味贡献显著,ROAV值为100。1-辛烯-3-醇是脂肪氧化酶作用于花生四烯酸的降解产物,具有蘑菇香、青香、蔬菜香以及油腻的气味,酶解前其含量为9.88%,经过酶解含量降低到3.83%。酮类物质含量也比较多,仅次于醛类。其相对含量由新鲜牡蛎的21.72%降低到酶解后的14.2%。新鲜牡蛎中主要的酮类物质为:苯乙酮(14.83%)、2,3-辛二酮(4.45%)等,而酶解后含量分别为9.42%和2.21%。2,3-己二酮是酶解之后出现的物质,新鲜牡蛎中的含量较少。酮类化合物来自于不饱和脂肪酸的热氧化降解、氨基酸降解或微生物的氧化作用。一般来说,酮类物质具有甜的花香和果香风味,如:2,3-辛二酮、2-壬酮、苯乙酮对牡蛎酶解前后的愉快风味有所贡献,但是酶解液中含量减少。呋喃类化合物大都具有很强的肉香味以及极低的香气阈值,主要是糖分解和美拉德反应的生成物。在酶解后呋喃类物质相对含量增加了44.34%,其中2-戊基呋喃是酶解液中主要风味成分,其相对含量由酶解前的2.12%增加到酶解后的6.03%。该化合物是一种典型的油脂氧化产物,具有豆香、果香、青香及类似蔬菜的香味。二甲基硫醚是海洋生物腐烂后所散发出的一种气体,具有刺激的洋葱大蒜等臭味,也是海洋腥臭味的主要来源。酶解液中相对含量增加至1.74%,其贡献值也增大。2.2姜汁是酶分解过程中的一种异味2.2.1姜汁对牡蛎酶解过程中氨基氮含量的影响由图2可知,通过对比未加姜汁的酶解液与加入姜汁的酶解液可以发现,两者氨基氮含量始终无显著性差异(P>0.05),说明姜汁的加入不影响牡蛎酶解过程中氨基氮的生成。2.2.2不同抗氧化产物的tbars对牡蛎酶解液风味的影响Siddaiah等发现,脂肪氧化指标TBARS与风味感官评分呈正相关,因此通过测定脂肪氧化产物TBARS来研究姜对牡蛎酶解液的风味改善作用。由图3可知,与其他两组相比,添加姜汁组在酶解过程中抑制氧化效果显著(P<0.05)。另外,添加姜汁组的TBARS值在酶解过程中没有显著性增加(P>0.05),说明姜汁对抑制酶解过程中脂质氧化有很好的效果。2.2.3姜酶解液添加量的测定加姜后牡蛎酶解液风味变化情况如图4所示,牡蛎加姜酶解有助于酶解液风味的改善。与未加姜酶解液相比,其腥味及哈喇味显著减少(P<0.05),令人愉快的水果气味显著增多(P<0.05),而青草香及肉香则变化不明显。姜汁特有的清香浓郁风味,较能令人接受。2.2.4使用使用淮山汁和汁中的抗氧化成分对牡蛎酶解过程脂质氧化裂解的影响经过比较加姜酶解液与未加姜酶解液的挥发性气体成分(表1),可以看出加姜酶解的牡蛎液中脂质氧化裂解产生的不愉快气味的物质,如:乙醛、(E)-2-戊烯醛、(Z)-4-庚烯醛、壬醛、2,3-辛二酮、1-辛烯-3-醇未被检测出,异戊醛,己醛、(E)-2-己烯醛等物质的相对含量分别减少了81.02%、33.28%、54.39%。另外,添加姜汁酶解的牡蛎液中检测到较多新的令人愉快的挥发性物质,如β-月桂烯(3.02%)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(9.25%)、对甲基苯乙酮(0.14%)、2-丁酮(0.93%)等。对加姜汁酶解液进行主成分分析(表2),可以看出加姜牡蛎液的主体风味成分有2-壬烯醛、对甲基苯乙酮、异戊醛、2-乙基呋喃