基于常染色体微卫星dna标记的亲子鉴定在畜牧生产中的应用

基于常染色体微卫星dna标记的亲子鉴定在畜牧生产中的应用

亲子筛选，又称亲权识别和个人识别，是一种利用生物、遗传和医学理论和技术分析后代和亲代形态结构或生理功能、遗传物质基础和其他特征的相似特征的方法。评估后代和后代之间是否存在亲属关系。亲子鉴定与人们的生产和生活关系密切,其在法医检验及畜牧业生产中具有重要价值。近年来,随着分子遗传学的发展,相继建立的基因组水平的多种分子遗传标记检测技术已应用到亲子鉴定中来。基因组水平的多种分子遗传标记检测技术,能够清晰地显示父本和母本的信息,具有遗传多态性高、检测快速、准确等优点,为亲子鉴定和个体识别检测提供了新的途径和方法。这些检测技术近年已在人类亲子鉴定、法医鉴定上得到了广泛应用,在动物的亲子鉴定和亲缘关系识别方面应用近年也有一些报道[10,11,12,13,14,15,16,17],但资料比较零散,不够系统。在现代动物育种中,由于不同的选种方法要利用各种亲属的表型信息,准确地系谱记录是十分重要的,但在有些情况下,如自然交配、混合授精等,不能准确地确认某些个体的亲缘关系,很可能会导致育种中遗传进展的降低。另外,在农村以放牧方式饲养的母畜所产的子畜,经常有畜主归属方面的司法纠纷。因此,家养动物的亲子鉴定在畜牧生产中具有重要的实际价值。在畜牧生产中,标准的三联体(即在母子关系是已知的情况下,确定假设父亲与子畜是否有亲生关系)和单亲(即只能获得一个亲本信息的情况下,确定亲生关系)两种情况下的亲子鉴定具有普遍意义。本文以云南文山黄牛为试验材料,采用检测方便、多态性丰富、共显性且呈双亲遗传的常染色体微卫星为遗传标记,设计了标准三联体和单亲两种情况下的亲子鉴定案例,来探讨常染色体微卫星DNA遗传标记用于不同模式下亲子鉴定的可行性,为畜禽亲子鉴定标准方法和流程的建立提供依据。1材料和方法1.1样品的预处理采集云南省文山广南县农村8头文山黄牛的血液样品。每头牛颈静脉取血10mL,肝素钠抗凝,然后与等体积的DNA保存液混合,带回实验室放入-80℃冰箱保存待用。8头牛的样品号及亲缘关系为(见表1):小牛1、小牛2、小牛3、公牛1、公牛2、母牛1、母牛2和母牛3。其中,小牛1的父、母亲为公牛1、母牛1,其假设父为公牛2;小牛2的母亲为母牛2;小牛3的母亲为母牛3。1.2方法1.2.1pcr扩增模板检测采用酚-氯仿方法提取全血基因组DNA,经琼脂糖凝胶(胶浓度0.8%)电泳和紫外分光光度法检测其纯度和浓度,稀释成50ng/μL浓度作为PCR扩增的模板。1.2.2引物的制备及合成采用联合国粮农组织(FAO)推荐的牛微卫星DNA多态性检测的10对引物,其在染色体上的分布、序列及PCR扩增等信息见表2,引物由上海生工生物工程技术公司合成。1.2.3taq酶反应PCR反应体系25μL,含模板DNA30~50ng,Mg2+浓度1.5~1.8mmol/L(因座位而异),10×buffer2.5μL,dNTP200μmol/L,Taq酶1.25U,引物0.2μmol/L。反应条件为:95℃预变性5min;94℃变性30s,54~66℃退火30s(因座位而异),72℃延伸30s,35个循环;72℃后延伸10min;4℃终止反应。1.2.4uvp电泳PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测后,取2μL上样,在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上100V电泳8h,银染显色,美国UVP凝胶成像系统照像。1.2.5基因型判读方法以分子量标记物(DL2000,北京TIANGEN)为标准,用Labwork4.0软件结合人工核对进行基因型判读。区分杂合子和纯合子。1.2.6数据分析(1)子整体学父的概率与随机公肉的概率的比较见表2父权指数(PI)是判断亲子关系所需的两个概率的似然比,即具有AF遗传表型的公畜(假设父亲)是子畜生物学父亲的概率(X)与随机公畜是子畜生物学父亲的概率(Y)的比值。PI=X/Y=(c×f)/(g×f)X(具有AF遗传表型的公畜是子畜生物学父亲的概率)=c(AF提供生父基因概率)×f(生母提供基因概率)。Y(随机公畜是子畜生物学父亲的概率)=g(随机公畜提供生父基因概率)×f(生母提供基因概率)。(2)相对复权rcppi/cst-1若假定父亲的相对父权机会等于或大于99.73%,即可以认定他是子畜的生物学父亲。2结果与分析2.1设置亲子关系的检测“标准三联体”是指在母、子关系是已知的情况下,要求鉴定假设父亲和子畜是否有亲生关系。本研究采用10个微卫星基因座对4头黄牛血样(即为小牛1、母牛1、公牛1和公牛2,其中母牛1与小牛1母子关系已确定,试验设定公牛1和公牛2为假设父亲)的亲子关系进行了检测,检测结果见表3。由表3可见,在BM1824,BM2113,ETH152,HEL5,ILSTS005,INRA063和TGLA122座位,公牛2与小牛1都不存在相同的等位基因,因此,排除了公牛2与小牛1存在亲子关系。而在检测的每一个座位,公牛1与小牛1都有一个相同的等位基因,这符合孟德尔遗传规律:子女的等位基因必定有一个来自父亲。经计算RCP值为99.9997%,根据亲权判定的标准,一般RCP值大于99.73%就确定存在亲子关系,由此判定本试验中的公牛1与小牛1是亲子关系。此结果与实际相符,因为采样时已确定小牛1的父亲为公牛1。2.2pcr扩增片段基因型判定单亲亲子关系鉴定也称为二联体亲权关系鉴定,即父子(女)或母子(女)亲生关系的确定。本研究采用10个常染色体微卫星基因座对4头黄牛血样(即母牛2与小牛2、母牛3与小牛3)进行了亲子鉴定分析。利用与凝胶成像系统配套的Labwork4.5软件,根据电泳结果确定每个扩增片段的大小并判定个体基因型,结果见表4。由表4中的基因型数据计算出母牛2与小牛2,母牛3与小牛3之间各座位的PI值。由此得到,母牛2与小牛2之间的累积父权指数CPI(1)=52,098,598.95,而母牛3与小牛3之间的累积父权指数CPI(2)=112,419,640.70。再由公式:RCP=CPI/(CPI+1)分别计算出母牛2与小牛2之间及母牛3与小牛3之间的RCP值,他们间的RCP值大于99.73%,近似等于100%。由此可见,母牛2与小牛2之间、母牛3与小牛3之间存在亲子关系。这与已知情况相符。但对于母牛2与小牛3来说,由于在HEL5,ILSTS005和TGLA122座位不存在相同的等位基因,排除了他们之间的亲子关系;同样,对于母牛3与小牛2来说,由于在ETH225,HEL5和ILSTS005座位不存在相同的等位基因,也排除了他们之间的亲子关系。3讨论3.1微卫星座亲子鉴定的一般结果标准三联体类型的亲子鉴定,在当前的畜牧生产中具有普遍性,特别是在自然交配、混合授精等情况下,要找出子代的父本个体,故本研究进行了这种类型亲子鉴定的探索。目前用于做亲子鉴定的遗传标记很多,但微卫星DNA标记分析有其独特的优点,如其个体识别率和亲子排除率高、所需检材少、对材料质量要求不高等。因此,在个体识别和亲子鉴定得到了广泛应用。使用微卫星分析,一般检测的遗传座位越多,得到正确鉴定结果的概率越大;同时,每个座位在群体中含有的等位基因数越多,得到正确鉴定结果的概率也会更高。ELLEGREN等研究表明,组合5个微卫星座位(每个有6个以上的等位基因)可使排除率达98%以上,使用10个这样的座位排除率可达99.99%。LUIKART等用分属于16条染色体上的22个微卫星座位对山羊进行亲子鉴定,结果在开斯米山羊(Cashmeregoat)中排除率大于0.999999%,在安哥拉山羊中排除率大于0.99999%,在萨能山羊中排除率大于0.9999%,同时证明两个个体完全相同的概率为1.0×10-15。本研究采用分布于黄牛10条染色体上的10个微卫星标记对4头符合“标准三联体”类型黄牛血样进行了亲子关系检测,经计算RCP值为99.9997%,根据亲权判定的标准,确定被测的公牛1与小牛1是亲子关系,而排除了公牛2与小牛1之间存在亲子关系,检验结果与已知情况相符,表明采用该标记进行亲子鉴定是可行的,具有很高的准确性。在本研究中实验设计的假设父亲只有2个,但这种情况的检测,在实际应用中假设父亲可以有一个到多个。在检测中虽然使用的微卫星标记数越多,结果越准确,但使用的微卫星标记数越多,检测成本和工作量都相应增加,故建议实际检测的标记数要适当。对于“标准三联体”一类的亲子鉴定检测选用5~9个标记比较合适,但每个遗传标记在群体中应该具有较高的多态性。3.2微卫星dna标记的遗传标记检测在广大的农村,以放牧方式饲养的母畜所生的子畜,经常有畜主的归属问题的司法纠纷。单亲亲子鉴定,多见于此类司法纠纷案件中,以母子(女)亲生关系的确定较为常见。这种类型的亲子鉴定由于缺少双亲某一方的分型检测资料,所获信息量少,因此确定亲子关系具有一定难度。本研究设计实验采用微卫星DNA标记进行了单亲亲子关系的检测分析,得出母牛2与小牛2、母牛3与小牛3之间的RCP值大于99.73%,近似等于100%。确定母牛2与小牛2之间、母牛3与小牛3之间存在亲子关系,而母牛2与小牛3、母牛3与小牛2之间不存在亲子关系,与已知情况相符。可见,采用微卫星DNA标记进行单亲亲子鉴定也是可行的。但应看到,由于缺少父亲的分型检测资料,所获信息量少,势必在排除信息和