改良马铃薯葡萄糖培养基的研究

改良马铃薯葡萄糖培养基的研究

pda-motata阻碍剂是马蹄葡萄糖培养基的缩写，即potata阻碍剂。这是一种固体半合成培养基。马铃薯葡萄糖培养基是一种运用十分广泛的培养基,适宜培养酵母菌、霉菌及蘑菇等真菌。在食品安全国家标准GB4789.15-2010中,马铃薯葡萄糖培养基可用于检测食品中的酵母菌含量。PDA培养基使用广泛,历史深远,关于PDA培养基改进的研究较少。传统PDA培养基的制作方法是:称取200g马铃薯,洗净去皮切成小块,加水1000mL煮沸20min,用纱布过滤,补足水分至1000mL,根据实验需要加葡萄糖和琼脂,溶化后再分装灭菌待用。传统的做法存在着原料浪费严重、操作较为繁琐与耗时长、不同批次培养基之间差别较大等问题。实验通过对PDA培养基在制作方法上进行改进,舍弃耗时长的马铃薯煮沸再过滤的方式,而采用马铃薯打浆的方式,力图达到简便工序,节省原料,提高PDA培养基质量,并切实提高该培养基酵母检出率的目的。1材料和方法1.1材料、培养基啤酒酵母,膜醭毕赤酵母:西南大学食品科学学院微生物实验室保存;马铃薯、红提、苹果、蛋糕:购于重庆市北碚区永辉超市;氯霉素:北京鼎国昌盛生物技术公司;PDA培养基:青岛海博生物技术公司;葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁等试剂均为国产分析纯。1.2a.企业bs-4g培养MJ-25BM05C搅拌机:广东美的精品电器制作有限公司;HH·BII·600-5型电热恒温箱:上海跃进医疗器械厂;BS-4G振荡培养箱:金坛市富华仪器有限公司;TOMYES-315型高压灭菌锅:日本TomyDigitalBiology公司;SW-CJ-1F医用型洁净工作台:中日合资苏州安泰空气技术有限公司;CH-8606型电子天平:瑞士天平仪器有限公司;UV-2450型紫外分光光度计:日本岛津公司。1.3培养基制备方法1.3.1n打浆、灌装、冷却马铃薯洗净去皮→称取切块→加适量水煮沸2min→打浆1min~2min→冲洗打浆机并定容到1000mL→加入葡萄糖20g,琼脂15g→溶化分装,121℃高压灭菌20min待用。1.3.2预处理将马铃薯洗净去皮,称取200g切成小块,加水1000mL煮沸20min,用纱布过滤,补足水分至1000mL,加入葡萄糖20g,琼脂15g,溶化后分装,121℃高压灭菌20min待用。1.3.3产品方法按照说明书使用,加热溶化后分装,121℃高压灭菌20min待用。1.3.4葡萄糖溶液制备溶解10g酵母膏,20g蛋白胨于900mL水中121℃高压灭菌20min,将20g葡萄糖溶解于100mL水中,115℃高压灭菌15min,最后将两者混合使用。1.3.5菌种,6.2o玉米粉60g,KH2PO43g,维生素B1100mg,蔗糖10g,MgSO4·7H2O1.5g,水1000mL,121℃高压灭菌30min,维生素B1单独灭菌15min后另加。1.4实验方法1.4.1培养基的设置将啤酒酵母和膜醭毕赤酵母接种于100mLYPD培养基中,在100r/min、28℃条件下活化24h。各吸取3mL菌液,用血球计数板法计其每毫升含菌数,确定最佳的稀释倍数。设置马铃薯浓度分别为40g/L、70g/L、100g/L、130g/L、160g/L的P1培养基为实验组,P2培养基和市售PDA培养基为对照组。参照GB4789.15-2010,将2种酵母菌各稀释合适的倍数,吸取1mL菌液加入灭菌的培养皿中,倒入P1培养基、P2培养基以及市售的PDA培养基20mL,摇匀后静置待琼脂凝固,置于28℃的生化培养箱中倒置培养,5d后观察菌落生长情况同时测量菌落大小,综合分析得出最佳的马铃薯浓度。1.4.2生长曲线测定生长曲线测定:以啤酒酵母为实验菌种,采用光电比浊法对酵母菌的生长进行测定。在500mL的锥形瓶中装入300mLP1培养基为实验组,装入300mLP2培养基为对照组(都不须添加琼脂),121℃高压灭菌20min,然后从试管中接入啤酒酵母,在30℃、120r/min条件下培养。将紫外分光光度计调到波长560nm处,预热30min,以未接种的培养基做空白对照。每隔4h吸取10mL培养基,测定其吸光度值。以时间为横坐标,吸光度为纵坐标,制作生长曲线。酵母菌发酵力测定:采用CO2失重法来测定发酵性能。将啤酒酵母分别在P1培养基和P2培养基中活化,取25mL对数期的菌液接入250mL玉米粉发酵培养基中,并称量首重。在30℃、120r/min条件下培养,每隔12h称一次瓶重,计算重量损失。以CO2失重量为纵坐标,时间为横坐标,制作发酵曲线。1.4.3红提苹果酱和蛋糕中酵母菌的检测结果参照GB4789.15-2010,设置国标培养基为对照组,改进后的培养基为实验组,分别检测红提﹑苹果酱和蛋糕中的酵母菌数,比较2种培养基在酵母菌检出率上的统计学差异。1.4.4处理数据运用Excel和t检验法,对实验数据进行统计分析。2结果2.1培养基的生长将膜醭毕赤酵母和啤酒酵母在YPD培养基中活化后,采用血球计数板法计得2种菌液含菌浓度分别为8.4×107个/mL和6.8×106个/mL,故确定稀释倍数确定为106倍与105倍。马铃薯浓度分别为40g/L、70g/L、100g/L、130g/L、160g/L的P1培养基和对照培养基按照1.4.1的方法接种后,置于28℃的生化培养箱倒置培养5d,实验组和对照组观察记录见表1、表2。膜醭毕赤酵母是一种新发现的拮抗酵母菌,分布广泛,具有较强的抗菌防腐作用和抗逆能力。其生长较快,在28℃培养5d菌落最大可达到4mm以上。由表1可知,马铃薯浓度为100g/L和130g/L时,直径>2mm的菌落可达到20.1%和20.9%。啤酒酵母生长缓慢,培养到期后菌落较小,实验组和对照组菌落大小均匀,直径都在2mm以内,相互之间没有明显的差异性。在2组实验中,市售PDA培养基所生长的菌落都是最小的。因为P1培养基是使用马铃薯全浆,当马铃薯浓度太高时,培养基中会出现絮状悬浮物,影响培养基的透明度,从而影响观察。当马铃薯浓度达到130g/L时,悬浮物可影响菌落的观察。结合表1和表2数据,确定P1培养基马铃薯的最佳浓度为100g/L。2.2结果表明，公母菌在性能试验中的综合结果2.2.1酵母菌的生长据2.1结果,实验组培养基(P1培养基)采用100g/L的马铃薯全浆、而对照组(P2培养基)采用的是200g/L的马铃薯煮沸过滤的形式,可知两者只有营养成分浓度上的差别,基本营养物质种类差别不大。将实验组和对照组接种完毕后开始计时,其生长曲线见图1、图2。酵母菌的生长大致分为迟滞期、对数期、稳定器和衰亡期。由图1可知,前30h菌种处于迟滞期,并且试验组和对照组没有明显差别。此时期菌种对培养基变化较为敏感,处于新陈代谢调整期,此时间较长,可能与啤酒酵母是直接从试管中接入有关。30h后菌体适应了新环境后,开始快速繁殖,试验组和对照组均进入长达18h的对数期,增长规律基本相似。只是对照组增长趋势略显平缓,最高点OD值为0.605低于实验组最高点的OD值0.717。可知实验组可以被酵母菌利用的营养物质浓度较高,使酵母菌在对数期代谢活跃生长繁殖更快,而对照组虽具有相同的营养物质但其浓度较实验组低,酵母菌繁殖速度低于实验组。2.3co失重量和发酵速率啤酒酵母在P1、P2培养基中活化后,取培养40h的菌液以10%的接种量接入玉米粉发酵培养基,表3与图3是啤酒酵母在120h里的CO2的失重量和发酵速率曲线。从表3可以看出,在120h内试验组产生的CO2总量多于对照组,通过F检验,在显著性水平α=0.05下,n=10,F=0.94,查表得F0.05/2,(9.9)=4.03,故p>0.05,即在α=0.05下2组数据没有统计学差异,即啤酒酵母在P1、P2培养基中活化后,发酵力没有发生显著性差异。2.4表1与表2试验结果使用改进后的培养基与国标GB4789.15-2010中的培养基,检测不同样品中的酵母菌,其结果见图2与表4。利用配对设计的t检验法来检验国标培养基与改良培养基在酵母菌检出率上的统计学差异,自由度v=2,t=2.03,查表得t0.1,2=1.886,知p<0.10,所以在α=0.10的情况下,改良培养基与国标培养基在酵母菌检出率上有显著性差异。3改良型培养基的制备马铃薯营养丰富,约含16.5%的碳水化合物,1.5%~