免亦能细胞功能测定试剂盒临床研究方案G-PMS-009

PAGE第2页共13页体外诊断试剂临床试验方案产品名称：Cylexeq\o\ac(○,R)-ImmuKnowTM免疫细胞功能测定试剂盒(化学发光法)商品名称：免亦能生产厂家：美国Cylex公司包装规格：12人份/盒

拟试验时间：

承担临床试验的机构（公章）：

主要临床研究者（签字）：联系电话：临床试验类型：

□新诊断试剂产品的研究□已有同品种批准上市产品的临床研究□关于变更申请中产品临床研究统计学负责人（签字）：联系电话：注册申请人（盖章）：上海健耕医药科技有限公司注册申请人联系人及联系方式：年月日

目录1产品原理 32产品的指定用途 33临床研究目地 34临床研究背景 34．1国内同类产品现状 45承担临床研究机构的要求 46临床研究方法的选择 57临床研究的设计 57.1样本量及样本量确定的依据 57.2样本选择依据、入选标准、排除标准和剔除标准 57.2.1选择依据 57.2.2入选标准 57.2.3排除标准 57.2.4剔除标准 67.3临床研究产品基本信息 67.3.1试验试剂信息 67.4研究中发生的问题及其处理措施 67.5临床研究统计分析方法 67.6临床研究数据统计分析的判断标准 77.7临床研究持续时间 78临床研究试验具体操作方案 78.1样品采集 78.2样品制备 78.3 试验流程 89成功和失败的可能性分析 99.1成功可能性分析 99.2失败可能性分析 1010有关安生性方面的说明 1010.1样品 1010.2试验产生的废弃物 1011风险的预测及事先应采取的措施 1012病人知情同意书及有关伦理事宜的说明 1113各方承担职责 1113.1申办者职责 1113.2承担临床试验的医疗机构职责 1114临床试验人员 1115参考文献 12附表1 131产品原理Mg2+虫荧光素+ATP+O2氧合虫荧光素+AMP+焦磷酸盐+CO2+光荧光素酶ImmuKnowTM检测经刺激物刺激后的血液在15～18个小时孵育期后细胞的免疫性。孵育期，在细胞对刺激物植入血球凝集素（PHA）反应中出现了Mg2+虫荧光素+ATP+O2氧合虫荧光素+AMP+焦磷酸盐+CO2+光荧光素酶2产品的指定用途本试剂盒通过测量CD4细胞刺激后的ATP浓度来检测细胞免疫性，从而反映免疫抑制患者的细胞免疫功能，为临床医生提供有效地信息。3临床研究目的本次临床研究中，我们选择240份1000份临床2-3家三甲综合医院的住院或门诊静脉穿刺血液样本为研究对象。Cylex公司生产的Cylexeq\o\ac(○,R)-ImmuKnowTM免疫细胞功能测定试剂盒(化学发光法)国内暂无上市的同类产品，所以通过CD4体外ImmuKnow检测，明确中国人肝移植后的免疫抑制状况。建立中国健康成人和免疫抑制治疗病人的ImmuKnow值正常范围。将ImmuKnow结果与CD4计数进行比较，进一步明确在中国人群中ImmuKnow与临床疾病相关性。明确ImmuKnow®检测的有效性、安全性和稳定性（设备和试剂盒）。4临床研究背景人体免疫系统包括两个截然不同但是相互影响的免疫类型：体液免疫和细胞免疫（CMI）。体液免疫由B淋巴细胞和它们产生的抗体调节。细胞免疫（CMI）由T淋巴细胞和它们的效应因子反应以及与其它免疫细胞的交互作用调节。CMI在不同的应用领域都是有价值的，包括：移植、传染病控制（例如：HIV，HCV）、抗免疫、癌症以及疫苗和药的研发。传统的应用于体内的测试方法，例如皮试，已经用于检测CMI，但现在需要又一种体外检测方法来快速的评估CMI。当今，用于评估CMI的体外方法包括：测量细胞活性信号、淋巴细胞扩散、细胞毒和细胞素产生的方法。大多数的方法用于测量淋巴细胞的免疫功能。这种方法是将淋巴细胞暴露在外周血液中进行刺激，刺激后导致淋巴细胞具有活性和扩张反应。受到刺激的淋巴细胞首先会离子流入和ATP合成酶增加，随后出现表面受体聚集、RNA合成、细胞素产生和释放以及DNA复制的现象。Cylexeq\o\ac(○,R)专利技术包括检测细胞免疫力的细胞刺激、细胞选择和测量细胞免疫代谢生化指标量化技术。这个化验利用的这些原则首先被用来评估老鼠免疫试验中T细胞对细胞抗体的反应。ImmuKonwTM能够检测用单克隆抗体覆盖磁珠的方法从血液中选择的CD4细胞内ATP合成刺激的早期反应。在刺激血液样本中存在的ATP数量是淋巴细胞活性的测量数据。因为CD4淋巴细胞协调CMI反应是通过免疫调节信号进行的，CD4活性的测量值反应了免疫细胞功能的等级。由于免疫压抑患者在治疗中的反应不同，所以评定患者免疫细胞功能可以在每个患者治疗的过程中提供给临床医生有效的信息。4．1同类产品现状国内暂无同类产品上市。国外只有Cylex公司生产的Cylexeq\o\ac(○,R)-ImmuKnowTM免疫细胞功能测定试剂盒(化学发光法)已上市。现由上海健耕医药科技有限公司代理申请国内的注册上市。5承担临床研究机构的要求根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则（试行）》要求，承担临床研究的机构应该具备以下条件：[1]从事人类健康或疾病预防、诊断、治疗以及流行病学调查等活动的法人单位，所研究产品在其所从事的专业范围内。[2]具有相应专业的技术人员，必须具有与研究试剂相适应的仪器设备，并能确保研究的实施。[3]省级医疗卫生单位。试验单位共3个：首都医科大学附属北京佑安医院、首都医科大学附属北京朝阳医院等，中国人民解放军总医院。本次临床试验要求总样本数不少于240例.分别由确定的2-3家省级医疗单位按照本方案分别独立开展试验，分别出具相应试验的分报告，由申请人完成最后的临床试验总结报告。6临床研究方法的选择此次临床试验为暂无同品种批准上市产品的临床研究，根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的规定，故通过CD4体外ImmuKnow检测，明确中国人肝移植后的免疫抑制状况。建立中国健康成人和免疫抑制治疗病人的ImmuKnow值正常范围。将ImmuKnow结果与CD4计数进行比较，进一步明确在中国人群中ImmuKnow与临床疾病相关性。明确ImmuKnow®检测的有效性、安全性和稳定性（设备和试剂盒）。证明新产品达到上市水平。7临床研究的设计7.1样本量及样本量确定的依据样本量确定：本临床试验所涉及到的诊断试剂为诊断试剂，按《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》规定，临床研究的总样本数至少为200例，至少有两家三甲医院参与临床试验，故我们考虑每家医院进行临床研究样本数最少为120例以上（两家合计240例以上），同时也满足统计学要求。7.2样本选择依据、入选标准、排除标准和剔除标准7.2.1选择依据以《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》及《医疗器械临床试验规定》作为选择依据。7.2.2入选标准－接受过器官移植，已经抽取静脉血进行其它项目检测，有剩余血液标本且距离抽血时间未超过30小时。男性和女性（数量大致相当），年龄18-64岁－健康个体，已经抽取静脉血进行其它项目检测，有剩余血液标本且距离抽血时间未超过30小时。男性和女性（数量大致相当），年龄18-64岁7.2.3排除标准－提取超过30小时的血液样本。－溶血或有凝块的样本。－长菌的样本。－样本ATP值>1000ng/ml或ATP值<1ng/ml。7.2.4剔除标准－因仪器或人为因素导致无法完成整个试验过程的样本。－病例资料不全的样本。7.3临床研究产品基本信息7.3.1试验试剂信息试剂名称：ImmuKnowTM-Cylexeq\o\ac(○,R)免疫细胞功能测定试剂盒(化学发光法)检测方法：化学发光法生产企业：美国Cylex公司7.4研究中发生的问题及其处理措施如试验中出现差异较大的样本测定结果,应做如下分析:A操作是否有误。B仪器状态是否正常。C样品状态是否正常。D试剂状态是否正常。经过上述分析,若是以上错误原因,应修正后重新进行试验;如果结果仍有较大差异则认为试验试剂存在问题，应终止试验。7.5临床研究统计分析方法使用ImmuKonwTM数据分析软件，方便转换和分析照度计的RLU数据。MicrosoftExcel或列表中提供的照度计RLU值可以直接被复制和输出到数据分析软件电子数据表中。ATP校正液浓度和RLU值按照记录数值绘图，线性衰退分析产生了一个定标曲线。为评估曲线的线性，每次检验都要通过在曲线上重新绘制RLU值并且计算相应的ATP值来重新进行分析。另外，要计算定标曲线的相应系数（r2）。7.6临床研究数据统计分析的判断标准免疫应答活性水平为低（≤225ng/mL）、中（226-524ng/mL）或高（≥525ng/mL）三个活性区间。①为保证化验的有效性必须遵循下面的标准：A.非刺激控制样本的ATP结果必须≤60ng/mL。B.刺激控制样本的ATP结果必须≥240ng/mL。②定标曲线的线性在下列标准下被接受：A.1000ng/mLATP校正液的测量值必须在900—1100ng/mL。（在数据分析软件报告表格Ⅳ的“平均值”涉及结果）B.100ng/mLATP校正液的测量值必须在85—115ng/mL。（在数据分析软件报告表格Ⅳ的“平均值”涉及结果）C.ATP定标曲线的相应系数（r2）必须≥0.97。7.7临床研究持续时间临床研究持续时间没有特殊的要求，一般分为几个部分：临床试验方案的设计和通过，试验的前期准备工作，试验的实施，试验数据的统计分析，临床试验报告。只要各临床研究单位严格按照本方案筛选到足够样本数即可结束临床研究，总体时间为约3个月左右。8临床研究试验具体操作方案8.1样品采集(a)样本为来自住院患者和门诊患者检测其他项目的剩余血液样本，处理过程中尽量避免溶血与污染。(b)血液样本在提取后30小时内运送到临床检验点，在室温下储存与运输。(c)与血液样本相关的样本和所有材料应该在2级生物研究安全性标准下操作。8.2样品制备采集的血液，放置于含有钠肝素的样本收集管中，标本应在30小时内检测，时间延长可能导致血液凝结导致不能检测。试验流程细胞刺激：①分几次逐渐地转化每次控制样本和患者的血液样本以确保血液细胞的均衡分配。②使用样本稀释液按1：4稀释整个血液样本。③根据工作表装配化验盘，每份样本都要使用一个8-孔条。④分配25ul样本稀释液发哦每个化验盘条开始的4个孔中，根据工作表将它们作为非刺激孔。⑤分配25ul刺激物到每个化验盘剩余的4个孔中，根据工作表将它们指定为刺激孔。根据分配100μL稀释控制样本到化验盘条1的每个孔中。⑥根据工作表，分配100μL每个稀释患者样本到每个适当的化验盘条的孔中。⑦分配25μL刺激物到每个化验盘条上剩余的4个孔中，根据分配100μL稀释控制样本到化验盘条1的每个孔中。⑧重新放置盘盖并在盘振荡器上摇动30秒。⑨在一个37℃/5%CO2孵育器中孵育覆盖的化验盘15-18小时。CD4细胞选择和ATP释放①从孵育器中移出化验盘，摇动盘振荡器3分钟。②涡动混合Dynabeadseq\o\ac(○,R)CD4，使用单次或重复使用吸液管分配50μL到每个孔中。磁珠必须彻底悬浮一以保证对每个孔持续添加试剂。注意：快速放置磁珠。在这一步不要使用多频吸液管，磁珠不容易在使用多频吸液管的试剂池中悬浮。③覆盖盘，用盘振荡器摇动15秒，在室温下孵育15分钟，再震动15秒，继续在室温下孵育盘15分钟。最后摇动盘15-30秒以使磁珠再次悬浮。④从化验盘中移出条，放置到装配磁盘上。为Dynabeadseq\o\ac(○,R)在孔边采集1-2分钟，这样可以从血液中分离出CD4细胞。⑤用一个8—通路抽吸管道连接在真空系统上，从每个孔中抽吸血液。⑥执行3个洗涤步骤，以从孔中消除剩余的自由细胞和干扰物质。注意：在垂直位置上使用一个多频吸液管来分配洗涤缓冲液。洗涤#1：分配200μL洗涤缓冲液到每个孔中，等1分钟，然后吸气。洗涤#2：分配200μL洗涤缓冲液到每个孔中，检查这些孔，并使用一个吸液管尖端从孔的各个面清除血液斑点。洗涤#3：分配200μL洗涤缓冲液到每个孔中。从磁性吸盘中移出条固定器，用盘振荡器摇动条1分钟，然后吸气。⑦分配200μL消化试剂到每个孔中。⑧从磁性吸盘中移出空条底座，用盘振荡器摇动条5分钟。⑨放置条固定器在磁性吸盘上，等待1-2分钟。⑩进入化验的第3部分。注意：如果在化验的第3部分存在超过4小时的延迟，在这个时候条应该被冷冻。在化验盘结构中去掉固定器的条。将条密封，在化验盘上放置盖，并且在-20℃冷冻。冷冻条在一个月内是稳定的。继续化验，从冰箱中移出盘，允许温度达到室温（18-28℃），在磁盘的条固定器上放置条，并重复上面的第8和9步骤。ATP测量提交化验工作表和装配测量盘包括：一个正常对照条每个患者一条两个标准曲线板条使用一个多频吸液管，根据工作表从磁盘的每个孔中分配50μL到测量盘合适的孔中。为每个条改变吸液管尖端。根据工作表分配每个水平的检验盘50μL到相同的测量孔中。使用多频吸液管，分配发光试剂150μL到测量盘的每个孔中。按照照度计生产厂家的说明，在添加发光剂后3到10分钟读盘。如果使用带有注射器的照度计，替代下面的步骤：首先使用发光试剂灌注照度计。确定分配剂量，传送150μL到每个孔中。为“发热”发光，根据照度计生产厂家建议选择综合/延迟时间。当使用注射器时，在添加发光试剂后不需要等待3分钟。9成功和失败的可能性分析9.1成功可能性分析本试验使用门诊和住院患者检测传染病的剩余血液进行测定，试验的样本量充足，由经验丰富的主管技师进行操作，应用的仪器设备一直在医院处于正常运行状态，检测流程简单、易重复、干扰试验的因素易受控制，因此试验的成功可能性极大。9.2失败可能性分析实验中出现断电、断水等，导致仪器不能正常运行，出现试验失败。但医院备有电源、辅助供水设施，不致出现上述情况。人员操作不当，导致试验失败。但本试验选择操作人员为具有多年临床操作经验的人员，将极少出现操作不当的现象。如果试验中标本没有达到要求，则会导致试验结果的不可信，导致试验的失败。10有关安全性方面的说明10.1样品由于试验过程中所用样本，均来自临床病人，全血样品的处理也应该按传染性物质处理，做好相应防护。10.2试验产生的废弃物按潜在传染性物质的处理规定执行，避免对人员环境的污染。11风险的预测及事先应采取的措施1临床试验开始时，临床试验单位应做好充分的准备，掌握本试剂及参比试剂的使用方法和相关技术，确保有充分的人力、时间保障试验的进行，预测能采集到足够的样本。申请者对本试剂的使用及相关技术对临床试验人员进行充分的培训，并提供足够的试验试剂。在没有做好充分的准备前，不开展临床试验。2本试剂盒为体外诊断试剂、本身不会对受试者造成直接的伤害。但临床试验的诊断结果不能作为医疗机构的诊断结果。临床试验负责人应时刻进行监督。3本试剂在试验中若出现和预期严重不相符的情况，应立即暂停试验，找出原因，再重新开始或停止临床试验。病人知情同意书及有关伦理事宜的说明因本产品（Cylexeq\o\ac(○,R)-ImmuKnowTM免疫细胞功能测定试剂盒(化学发光法)）为体外诊断试剂，我们进行本次临床试验采用入选患者的样本时获得了患者的知情同意，所有入选患者签署知情同意书。13各方承担职责13.1申办者职责（1）与医疗机构共同设计、制定医疗试验方案，签署双方同意的临床试验方案及合同；（2）向医疗机构免费提供检测合格的受试产品及相关消耗品；（3）试验前对临床试验人员进行相关培训；（4）负担与试验相关的费用，承担试验单位的劳务费。（6）申办者中止医疗器械临床试验前，应当