植物内流型钾离子通道基因的研究进展

植物内流型钾离子通道基因的研究进展

钾是植物生长所必需的大量因素，在植物生长发育过程中对植物生长发育具有重要的营养和生理作用。随着人们对植物钾吸收和利用的生理及分子机制研究的深入,发现植物根系对钾的吸收涉及到两类吸收系统——高亲和性吸收系统和低亲和性系统。高亲和性吸收系统是植物在低钾条件下(胞外K+浓度1～200μmol/L)的主要吸收途径,是通过细胞膜上K+转运载体系统来实现的一个主动转运过程;而低亲和性吸收系统则是植物在高钾条件下(胞外K+浓度高于0.5～1.0mmol/L)的主要吸收途径,是由细胞膜上K+通道蛋白所介导的一个被动转运过程。钾离子通道是植物吸收K+的重要途径之一。SCHROEDER等利用膜片钳技术于20世纪80年代首先在蚕豆细胞中证实了钾离子通道的存在,随后,通过采用酵母双突变体互补法又从拟南芥、马铃薯、大麦和小麦等植物中分离得到多种类型的K+通道。根据通道对电势依赖性及离子流方向的不同,钾离子通道可分为:内向流型钾离子通道(K+in)和外向流型钾离子通道(K+out)。这两种K+通道具有不同的动力学特征,通常认为是两种蛋白,都具有电势依赖性,其差异表现在它们的电压、Ca2+和pH依赖性方面。这两种K+通道存在于各种植物的细胞膜中,如保卫细胞,糊粉层细胞,叶片细胞,茎组织,叶肉细胞和中柱等。已有研究表明,内向整流型钾离子通道是植物K+吸收的主要途径,对其分子生物学的研究也较为清楚。植物内向整流型钾离子通道主要存在于细胞质膜上,具有特殊的电势依赖性。K+in通道主要有2项功能:(1)为低亲和力K+吸收提供一条途径,吸收由H+泵建立的膜电压驱动;(2)调节膜传导性和感受细胞内外K+浓度梯度而影响膜电压的控制。在细胞膜超极化的电压条件下,内流型钾离子通道被打开,从而介导钾离子流入胞内和调控膜蛋白。植物细胞膜上的K+in通道对植物根,胚芽鞘,维管组织等部位的K+内流,膜蛋白的调控,气孔开闭等各种细胞功能中起着重要的作用。大麦、黑麦草和玉米等植物中的K+in对K+表现为低亲和性,然而,在向日葵和拟南芥中,低钾的情况下,K+内流量和K+通道的活性都有所提高,表现为高亲和性。随着分子生物技术的发展和应用,目前已克隆出了许多与钾离子吸收有关的通道基因。外源高亲和性钾通道基因的导入不仅可以提高肥料钾和土壤缓效钾的利用率,而且可以显著增加植株的钾含量,使植物产量和品质得到较大幅度的提高,从而开辟利用外源基因改良植物营养遗传特性的新途径。1k+in通道基因到目前为止,已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离得到了许多K+in通道基因,这些通道基因的表达特性各有不同,常见的有两种分类方法。SCHROEDER等根据其结构域的不同,把这些K+in通道基因分为KAT亚族和AKT亚族(表1)。ELIDE等根据内流型钾通道基因的结构和DNA序列的分析,把它们分为4个大组(表2),其中Ⅲ组为弱内向整流型钾离子通道[7,8,9,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32]。2tyr-gly序列及-亚基这些K+in通道(图1)具有S1～S6六个跨膜结构域和一个位于S5和S6之间的P结构区域(又称为H5区域)。S4是通道电压敏感区,是一个Arg/Lys-Xaa-Xaa-Arg/Lys重复序列区,对跨膜电压变化产生反应,导致通道门开放所必需的。P结构区域是离子通道孔径形成区,含有离子结合部位,其中间在内,两端暴露在外,呈β发夹状。H5中GYGD片段的存在表明它是一个高度保守的K+选择区。该区域氨基酸残基的微小变化都会直接影响离子的选择性与导度,如苏氨酸和苯丙氨酸分别被丝氨酸替换时,对Rb+和NH4+的导度增加。在-COOH端有一个锚蛋白相关区(ANKY)和一个环核苷酸结合位点(NBS),锚蛋白区在环核苷酸结合位点的下游,与其它蛋白质之间的相互作用有关。目前认为锚蛋白相关区只存在AKT1及相近K+的通道,KAT1没有ANKY。保守的N-端可能在亚基间及它们在胞质集合装配时起特异识别作用。具有生理功能的钾离子通道可能是由4个分子量为65～100kD的α-亚基和一个β-亚基组成的同源四聚体(图2),其中α-亚基上有P-回环形成的狭窄的选择性过滤器(SF)(图3)和电压敏感器(VS)。X射线晶体学显示,选择性过滤器长1.2nm,孔径约为0.3nm,K+脱水后(直径约为0.26nm)恰好可以通过。过滤器中每一个亚基都存在着一个保守的TVGYG序列,每一个序列氨基酸上的羧基氧原子都指向孔道。每8个氧原子以一个近似方形棱镜的形式包围成一个K+适宜的结合位点,过滤器存在4个位点,从胞内到胞外分别定义为位点1～4。K+通道一个独特的结构特征是孔道内有一个部位可以膨胀到1.0nm,称为中心腔,位于选择性过滤器的胞内侧,细胞膜的中间。中心腔中可以容纳一个K+,其它空间则充满了水。通道胞外侧的出口处存在两个适宜K+结合的位点。钾离子通道孔的氨基酸序列是高度保守的,Tyr-Gly序列在离子选择性中起到重要作用,离子通道对离子选择性差异可能就在于Tyr-Gly序列在离子通道氨基酸序列上位置的不同。β-亚基具亲水性,可能起到调节的作用。AKT1基因是1992年SENTENAC等于利用酵母的吸钾缺陷突变体,从拟南芥cDNAA文库中分离得到的,它是第一个克隆得到的植物K+通道基因。AKT1长2649bp,其中阅读框为2517bp(核苷酸从58～2574),编码838个氨基酸的蛋白质,相对分子质量约为95.4KD,其-COOH端有锚蛋白区(ANK)且N-末端较短,为60个氨基酸,C-末端较长,有562个氨基酸组成。研究证明,AKT1与Shaker家族的结构相似,它具有6个跨膜区域S1,S2,S3,S4,S5,S6及一个P(H5)结构域。LKT1,ZMK1,QsAKT1,DKT1和AKT1结构相似,其-COOH端都有锚蛋白区。KAT1是1992年,ANDERSON等通过应用吸钾缺失的酵母突变体,通过功能互补法从拟南芥中分离得到的植物K+通道基因。其基因的阅读框含有2031个核苷酸,编码677个氨基酸,相对分子量约为78kD。该蛋白可能有7个跨膜结构,其中有6个结构成串排列在多肽的N端,这一结构是所有电压敏感Shaker族K+通道的结构特征。KST1是1995年,MUELLER-ROEBER等从是从马铃薯的保卫细胞中分离得到的钾通道基因。它长约2381bp,可编码689个氨基酸的多肽。其结构与Shaker型的K+通道类似,所编码的蛋白也有S1,S2,S3,S4,S5,S6和H5区。KST1,SIRK,KZM1,KPT1和KAT1结构相似,在-COOH端没有锚蛋白相关区[5,8,9,17,18,24,28]。AKT2是利用AKT1作为探针,从拟南芥cDNA文库中克隆得到的。其基因编码由802个氨基酸残基组成的蛋白质,相对分子量约为91.3kD。AKT2的多肽序列有6个可能的跨膜结构,为S1,S2,S3,S4,S5,S6及一个P(H5)结构域,及包含有6个糖基化位点和15个磷酸化位点。氨基酸糖基化位点和磷酸化位点是跨膜蛋白所特有。ZMK2,SPICK1SPICK2与AKT2相似,它们都编码弱内向整流型钾离子通道,其基因产物在-COOH端具有锚蛋白相关区[7,8,20,23,29,30,31]。AtKC1和KDC1是分别从拟南芥和胡萝卜根中分离和克隆出来的,他们的基因产物均没有锚蛋白相关区。3k+吸收促进k-ras1的表达AKT1基因在拟南芥中表达部位主要集中在成熟根的表皮、皮层和内皮层,叶组织中则很少,有可能参与土壤溶液的K+吸收。较KAT1而言,其对K+有更高的选择性,其选择性依次为:K+>Rb+>Na+>Li+,通透比P+I/P+Hb是KAT1的10倍,对cGMP敏感。AKT1通道能促进植物对K+的吸收,影响根细胞的生长发育。与野生型相比,插入T-DNA的AKT1基因的突变体植株能够生长在K+浓度为微摩尔级的介质上,这表明AKT1类的钾离子通道主要吸收微摩尔级的钾离子。LKT1是从番茄根毛特化的cDNA文库中克隆出来的,在根毛中表达强烈。其编码的多肽中有97%的氨基酸序列与马铃薯的SKT1一致,且它们在生理功能上也有相似性。ZMK1通道基因是从玉米胚芽鞘中分离得到的,主要在皮层表达。在卵母细胞中的表达表明,ZMK1通过外部酸化激活钾离子内向整流通道。QsAKT1通道基因来源于水稻特化的cDNA文库,主要在根部表达,叶片中也有少量表达。其表达具有明显地细胞特异性,如:在根部,它在表皮和内皮层细胞中表达强烈,而在脉管系统和外皮层细胞中表达量较少。有研究表明,其在盐胁迫下水稻的K+吸收过程中起到重要作用。DKT1是由ELIDE等人从胡萝卜中分离得到的一种内向整流型钾离子通道基因,主要在叶片中表达,在根、茎、子叶等部位也有表达。其与AKT1有82%的同源性,与LKT1有85%,可能参与了植物营养物质吸收和其他一些生理过程。KAT1的表达具有组织特异性,在拟南芥根、茎保卫细胞和液泡组织中表达。TEA+或Ba2+等K+通道专一性抑制剂对其影响较大,秋水仙素能够降低KAT1的表达。SCHACHTMAN等于1992年报道,在表达KAT1的卵母细胞中,其表达的内流通道在-130mV时,10mmol/L的TEA+或Ba2+可分别抑制K+内流的81%和70%。KAT1可能在调节气孔开放和K+向液泡中转运起作用,而不是直接从土壤中吸收K+在卵母细胞中KAT1的离子选择性是K+>NH4+>Rb+>Na+-Li+-Cs+。KAT1对NH4+有较显著的通透性,NH4+可能会抑制KAT1对K+的吸收,KAT1通道也可能是NH4+进入细胞的途径之一。KST1与KAT1有81%的相似性,相同的氨基酸高达63%。KST1主要在花和叶中表达,而在茎节、块茎和根中则不表达。其基因产物主要存在于气孔的保卫细胞中参与气孔的开闭。它对抑制剂Cs+高度敏感,并且受到细胞外部pH和细胞内部ATP的影响。在卵母细胞中表达表明,KST1对的K+高度选择性与SKT1相似,选择性吸收顺序是:K+>Rb+>NH4+>Rb+>Na+,Li+。但是与SKT1相比,KST1的通道激活时间是呈二次指数级增长而不是多次指数级增长;KST1和SKT1的半激活时间分别是:-140mV条件下(122±52)ms和-100mV条件下(217±61)ms,激活通道的电压比SKT1低。SIRK是PRATELLI等人从葡萄藤植物中分离得到的一种K+in通道基因。它在葡萄藤的保卫细胞中表达,在拟南芥的木质部薄壁组织中也有表达。SIRK基因与KAT类型的内流型钾离子通道基因有高度的相似性。SIRK的电压门值为2.8,KAT2的为2.5,KAT1的为1.6;SIRK的半激活电压为-161mV,KAT2的为-152mV,KAT1的为-130mV;此外,0.1mmol/LCs+的存在,就能够抑制SIRK通道K+的流入。可见,与KAT1相比,SIRK的电压门特性与KAT2的很相似,与KAT2的功能特性很相似。SIRK通道的选择性依次为:K+>Rb+>Na+。KZM1是来源于玉米的一种内向整流型钾离子通道,主要在玉米的保卫细胞和脉管系统表达。其功能可能与KAT2相似,但较KAT2而言,它不受外部环境酸化的影响。KPT1是由Hedrich等从白杨中分离得到的,在保卫细胞和芽部位表达。其基因产物可能与保卫细胞的开启和芽生长时K+的吸收过程有关。AKT2与AKT1有60%的同源性,但AKT2主要在叶片中表达,而AKT1主要在根部表达,其能在卵母细胞中表达并且具有转运K+的作用,是电压门控的内向整流型K+通道。ZMK2是从玉米胚芽鞘中分离得到,在脉管系统表达。其是依电压独立性及质子禁止性通道方式调节K+的内流和外流。SPICK1和SPICK2是从雨树(Samaneasaman)中分离得到的,在叶片中表达。其受到光和自身生物钟的调控,此外,SPICK2还受到磷酸化的调控。AtKC1是REINTANZ等从拟南芥中分离克隆得到的一个新的α-亚基类K+通道基因,主要在根毛区和根的内皮层表达。它的α-亚基是根毛钾离子吸收通道的重要组成单位。KDC1是从胡萝卜根中分离和克隆出来的,在胡萝卜根毛细胞中有较高水平的表达。它不能单独在卵母细胞中表达,当它作异源表达时,它是一个电压和H+依赖性的内向整合型钾离子通道,其基因产物能够介导K+流的产生。4不同cs+对转植株的保水性人们已对从植物中克隆得到的多个K+in通道基因进行了较为深入的研究,并通过基因工程技术,将KAT1和AKT1钾通道基因相继转入拟南芥、水稻和烟草中,使转基因植株在吸钾速率和对钾的累积能力等方面与对照相比都有明显的提高。通过根癌农杆菌介导法,ICHIDA等将KAT1钾通道基因转入拟南芥植株中。通过对转基因植株的研究发现,表达KAT1K+in通道基因的拟南芥植株的保卫细