乌头碱对大鼠心律失常模型的影响

乌头碱对大鼠心律失常模型的影响

现在，对抗心力衰竭药物模型的筛选和评价存在许多问题：1。体动物模型对药物反应的影响因素多，药物反应的动物与人体差异大，甚至存在质差异。2.乌霉碱通常被认为是诱导大鼠心律失常模型，并且大多数阳性对照药物的疗效不佳。3.大腿骨移植引起的复发性心律失常模型更多，主要表现为大腿骨移植后的大变化，通道位置难以每个位置，受体速度也会影响心律失常的严重程度。实验动物的性别和体重影响模型的稳定性和可靠性。上述因素严重影响了抗心律失常药物的评价和筛选。因此急需稳定、可靠、准确的筛选和评价抗心律失常药物的模型。本文应用酶解法分离单细胞,结合膜片钳技术,建立单细胞筛选和评价抗心律失常药物模型。1材料和方法1.1实验动物无特殊病原微生物大鼠,♀♂各半,体重200～250g(Ⅱ级,No09-2-1),由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。1.2电极液mmoll-1台氏液含(mmol·L-1):NaCl126,KCl5.4,MgCl21,CaCl21.8,NaH2PO40.33,glucose10,HEPES10,NaOH调pH为7.4;KB(Kraftbrune)保存液含(mmol·L-1):glutamicacid70,taurine15,KCl30,KH2PO410,MgCl20.5,egtazicacid(EGTA)0.5,HEPES10,glucose10,1%albumin,KOH调pH为7.4;电极液(mmol·L-1):KCl20,potassiumasparate110,MgCl21,HEPES5,EGTA10,Na2ATP5,KOH调pH为7.2。胶原酶(Ⅱ型),EGTA,牛磺酸,小牛血清蛋白(BSA)以及乌头碱均购自Sigma公司。1.3对心脏组织的分离方法同以前文献报道将大鼠用2%的戊巴比妥钠麻醉后开胸,迅速取出心脏,主动脉逆行插管连于Langendorff灌流装置上,以正常台氏液约8ml·min-1连续灌流5min,洗去心脏残血,然后用无钙台氏液灌流约10min,心脏停止搏动后,应用含0.05%Ⅱ型胶原酶的无钙液灌流分离心脏单细胞,当心脏变软、色泽变浅时开始取心肌组织,每隔2min取1次。以上操作均在37℃恒温,并充0.95O2+0.05CO2条件下进行。将不同时间取下的心室肌组织放于装有KB液的试管中,用吸管轻轻吹打,使之分散成单个细胞,置于4℃冰箱稳定1h待用。选择杆状、耐钙、横纹清晰无颗粒的细胞进行实验研究。1.4细胞外液的脉冲激光雷达实验方法应用全细胞膜片钳技术记录单细胞离子电流。所用微电极用两步法拉制而成,制成的微电极充灌电极液后电阻在2～3MΩ之间。将准备好的微电极连于膜片钳仪(Axopatch200B,AxonUSA)的探头上。分离好的单细胞置于浴槽中,用正常台氏液以3ml·min-1恒速灌流冲洗细胞表面,形成高阻封接(>10GΩ)后,用脉冲式抽吸打破细胞膜,形成全细胞构型,用电压钳和电流钳模式进行刺激和记录。实验过程由计算机软件pCLAMP6.04(AxonInstrument)控制,数-模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。电极液和细胞外液之间的液接电位(10～11mV)未补偿。信号输入经过1KHz的滤波,数据存于计算机硬盘以便分析。实验在室温(19～22℃)下进行。2观测指标2.1动作电位apd形成全细胞构型后,应用电流钳,在保持电压0mV条件下,给予一持续2ms的80mV的脉冲刺激,使心肌细胞产生一次动作电位。2.2mmoll-1的制备大鼠心室肌细胞钠电流的记录是在细胞外液中低钠(5mmol·L-1,其余用等渗氯化胆碱取代)、室温下进行。保持电压-80mV,刺激电压从-70mV开始,以10mV步阶阶跃至+30mV。2.3cshs的取代在室温下(19～22℃),将细胞外液中的NaCl用等摩尔的氯化胆碱取代,用CsCl和CsOH分别取代相应的KCl和KOH,即无钠、无钾外液,电极液同样无钠钾,从而排除钠电流、钾电流的干扰。在钳制电压模式下记录,保持电压-80mV,刺激电压从-40mV起以10mV步阶给予去极化刺激至+50mV,持续时间100ms,间隔时间10s。2.4钾电流大鼠心肌细胞以瞬时外向钾电流(Ito)为主,同时记录内向整流钾电流(Ik1)。2.5统计分析数据以ˉx±s表示。用配对t检验分析给药前后动作电位时程和离子电流的变化。3结果3.1-mol-1和apd50对大鼠心肌动作电位的影响形成全细胞构型后,在电流钳模式下记录正常动作电位,钳制5min后,给予乌头碱1μmol·L-1,分别记录给药后1、5、10min的动作电位,给药15min后用正常台氏液以3ml·min-1冲洗,冲洗15min后记录动作电位时程。结果表明乌头碱能够延长APD,使大鼠心肌细胞复极50%的动作电位时程(APD50)由(103.35±7.71)ms延长至(176.4±16.43)ms,使复极90%的动作电位时程(APD90)由(150.23±7.02)ms延长至(236.03±23.22)ms(P<0.01,n=8),但APD50,APD90冲洗15min后恢复不明显。应用奎尼丁10μmol·L-1后APD90进一步延长至(316.15±67.39)ms,与乌头碱组比较有显著意义。但应用维拉帕米10μmol·L-1后动作电位时程恢复近正常。结果见Tab1及Fig1,2。3.2除极化电压下mv将分离好的大鼠心室肌单细胞置于1ml灌流槽中,细胞附壁后,以正常台氏液灌流冲洗,形成全细胞构型后,保持电压-80mV,以10mV步阶阶跃至+40mV,持续时间100ms,分别记录各除极化电压下的电流。结果提示灌注乌头碱1μmol·L-15min后,发现乌头碱增加INa,当除极电压在-50mV时INa从(254±55.3)pA增加至(4530.2±475.1)pA(n=4,P<0.01);当灌注奎尼丁5min后INa电流被抑制,应用奎尼丁10min后抑制率为33.59%,结果见Fig3,4。3.3灌注东北部小鼠心肌组织ica-l本研究中ICa-L记录过程无衰减(衰减5%则弃之不用),实验中浴槽液体及电极液无钠钾,从而排除钠、钾电流的干扰。记录ICa-L保持电压-40mV,刺激波宽300ms,步阶电压10mV。大鼠心室肌细胞ICa-L电流峰值在刺激电压0mV至10mV区间,当灌注1μmol·L-1乌头碱5min后,ICa-L增加,除极0mV电位时ICa-L从(727.9±178.0)pA增加至(1082.1±222.2)pA(n=6,P<0.01)。灌注乌头碱使大鼠心室肌细胞ICa-L增加时,灌注维拉帕米10μmol·L-15min后发现维拉帕米减少乌头碱诱发的ICa-L增加,15min后作用最强,抑制率达120%。此作用不是ICa-L的衰减,因用正常台氏液冲洗后该电流恢复正常。结果见Fig5,6。3.4钻头碱对ik1表达的影响全细胞构型形成后,在电压钳模式下记录Ik1电流。Ik1电流的激活:保持电压固定于-40mV,在-120～+60mV之间,每隔10mV连续给予超极化和去极化刺激,脉冲持续300ms,刺激间隔时间10s。以300ms稳态值作为测定Ik1电流值。预先在细胞外液中加入CdCl2300μmol·L-1以阻断ICa。结果表明,乌头碱增加内向整流钾电流的内向成分,在-120mV的刺激电压下,Ik1的内向成分从(2007.1±359.3)pA增加至(2317.7±401.8)pA(n=10,P<0.01),在实验电压-30mV条件下,乌头碱减弱Ik1的内向整流趋势,即电流由正常的(-22.796±9.20)pA增加为外向趋势(2.98±1.89)pA(n=10,P<0.01)。乌头碱对大鼠心室肌细胞Ik1的作用如Fig7,8所示。3.5ito的电流幅度细胞外液中应用Cd2+0.3mmol·L-1,Ba2+0.2mmol·L-1分别阻断ICa和Ik1,从保持电压-70mV激活至+40mV,步阶电压为10mV,持续1000ms,以外向电流峰值表示Ito的电流幅度。结果表明乌头碱具有一定的抑制瞬时外向钾电流的作用,实验电压为+50mV时,Ito外向电流峰值由正常对照的(3391.4±522.3)pA下降到(2956.3±504.9)pA(P<0.01,n=6fromsixrats)。结果如Fig9,10所示。4抗心力衰竭药物筛选及评价指标4.1结合拉多通道改良型模型一个理想的抗心律失常药物自身对动作电位时程无缩短作用,但应使乌头碱延长的动作电位时程缩短或恢复正常,维拉帕米有此作用,可作为此模型的阳性对照药。4.2钠电流阳性对照药可选奎尼丁,应用奎尼丁后钠电流幅度低于正常值,但奎尼丁过度延长动作电位时程,临床表现为具有诱发LQT的潜在危害。4.3钙Ⅳ类抗心律失常药物应具有抑制乌头碱增加L-型钙电流的作用,阳性对照药可选维拉帕米。5抗心律失常药物的筛选模型抗心律失常药物的研制开发仍然是当前国内外研究的热点,但近年来开发成功应用于临床的药物却微乎其微,且药物开发中往往因实验动物模型的结果和临床人体对药物反应差距较大,影响了新药研制开发。传统的抗心律失常药物实验动物模型均存在共同的不足,如个体差异大、临床符合率低等。因此,建立新的抗心律失常药物筛选模型是新药开发的关键和基础。以往研究证明乌头碱是INa激动剂,是该试剂诱发心律失常的机制,我们研究证明其对INa有促进作用,但对ICa-L和IK1亦有明显的增加作用,对Ito呈现抑制作用,明显延长APD,这些也是乌头碱诱发心律失常的主要机制,对乌头碱诱发大鼠心律失常模型阳性对照药以往选奎尼丁,但此研究结果提示阳性对照药应首选胺碘酮、维拉帕米。近年来时有报道乌头碱诱发严重的心律失常,应用胺碘酮治疗疗效甚好。但由于对乌头碱诱发心律失常的离子机制仍认为是激动钠通道,限制了对乌头碱中毒的成功治疗。除少数几个抗心律失常药物外,多数抗心律失常药物往往不同程度延长APD,过度延长APD易出现长Q-T间期综合征,诱发尖端扭转型心律失常,一个理想的抗心律失常药物应适度抑制INa,ICa-L和IK1,对APD适度延长或使APD恢复正常水平。本研究建立的药物筛选模型,选择单个心室肌细胞作为研究对象,以电生理指标为观测指标,同时观察了目前公认的几大类阳性药物对本模型中乌头碱诱发的大鼠单个心室肌细胞动作电位时程和离子电流改变的治疗作用,结果表明,Ⅰ类抗心律失常药物奎尼丁具有抑制乌头碱增加钠内流的作用,但研究发现,该药物加重乌头碱诱发的动作电位时程延长,这也与临床上奎尼丁诱发长Q-