P53与肝癌的基因治疗

p53与肝癌的基因治疗2023级争论生四班：许腾、庄步强、高庆强、刘稳顺、江海波

2023/10/301肝癌机制抑癌基因p53p53基因与肝癌的基因治疗存在的问题展望2023/10/302

肝癌概念：指肝细胞或肝内胆管细胞较常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食管癌本病以40～49岁为多，男女发病率之比为2～5∶1每年新增病例：50多万主要临床表现：肝区苦痛、肝脏肿大、黄疸、肝硬化病症等治疗：手术、介入、放疗、化疗、生物和免疫治疗等5年病死率：超过95%发生的癌肿2023/10/303

机制肿瘤发生进展过程中，由于各种基因表达及其调控的变化，使细胞在信号转导网络上表现出与正常细胞的显著差异。正常细胞的一些信号转导通路在肿瘤细胞中表现为过度活泼，而另一些信号转导通路则被阻断。这种细胞内信号转导的特殊干扰了细胞对增殖、分化、凋亡等多方面的自身调控，特殊是造成细胞增殖和凋亡失控，成为肿瘤发病的重要分子根底。随着分子生物学和免疫学技术的飞速进展，基因治疗技术在肿瘤的治疗中具有宽阔的前景。基因治疗的方式有两类，一类为基因矫正与置换，立刻缺陷基因的特殊序列进展校正，对缺陷基因进展准确的原位修复；另一类为基因增补，不去除特殊基因，而是通过外源基因的非定点整合，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能，到达治疗目的的一种方法。2023/10/304

抑癌基因抑癌基因的突变、缺失及失活在肝癌的发生进展中起着关键性的作用。目前，新觉察的抑癌基因层出不穷，较常见的有p53、p16、Rb、BCL-XS等。随着人们对肝癌发病机制的深人了解，越来越多的证据说明：p53基因的突变与失活和肝癌的发生进展有着亲切联系。近年来，随着手术、放疗及生物治疗等方法的争论进展，使肿瘤综合治疗水平有了明显提高，尤其是肿瘤体外细胞和动物模型基因治疗，渐渐从单纯的根底争论过渡到临床争论和应用。本文主要从p53在肝癌基因治疗方面作一简要介绍。2023/10/305

p53生物体全部组织都存在p53蛋白，在整个进化中变现高度保守。虽然p53对生命不是必需的，但是在细胞水平维持遗传稳定性起关键作用。这是极端重要的，由于遗传损伤渐渐导致肿瘤发生和产生癌。六分之一人群由于p53功能缺陷进展成癌这一统计推断，强调指出p53作为一种肿瘤抑制蛋白的重要性。在对DNA损伤应答时激活p53蛋白，以转录因子而起作用，能结合DNA特异序列〔p53应答元件〕，而且上调靶基因的表达。在这些条件下，p53诱导细胞生长停顿或者程序性细胞死亡〔凋亡〕。这两种应答预防细胞群内遗传损伤的复制和扩增。2023/10/306DNAdamagep53CellgrowtharrestApoptosisp53activationandaccumulation2023/10/307细胞内p53蛋白的浓度增加是其对DNA损伤的应答。这种作用不依靠于基因转录而涉及转录后的调控机制，与预先存在p53mRNA增加的翻译有关。在整个基因表达调控中，转录后的机制是重要的，而且特殊是可能比转录调控有更快的应答。该过程涉及胞浆内mRNA-蛋白质的相互作用，但是p53浓度增加的准确机制是不清晰的。2023/10/308

p53基因与肝癌的基因治疗p53基因应用于肝癌的基因治疗,是以正常的野生型p53基因替代肝癌细胞中突变的p53基因。利用基因转染肝癌细胞，查找高效、导向性的载体系统成为肝癌基因治疗临床应用的关键。目前,向肝癌细胞内导人外源基因的方法主要有病毒法和非病毒法两种。2023/10/309病毒法常用的病毒以逆转录病毒和腺病毒作载体，其中逆转录病毒载体只感染处于分裂期的细胞，如肿瘤细胞，而对高分化不分裂的细胞就不能实施基因转移。腺病毒载体则对各期的细胞均可感染，所以目前腺病毒载体更常用作p53转移的载体，腺病毒介导的p53基因治疗已广泛开展。2023/10/3010Rei-setM等通过试验证明：腺病毒介导的基因转移可有效地将p53基因导人肿瘤细胞中；以GFP为报告基因，观看到了腺病毒对肝癌细胞BEL402、HLE及HuH7均有很高的转染率，腺病毒能有效地将目的基因导入肝癌细胞中并高效表达。BIY2102腺病毒载体转染后能显著提高p53突变的HIE和HUH27细胞对顺铂和丝列霉素2C的敏感性，增加了化疗药物对HIE和HUH27细胞的杀伤作用，这为以腺病毒为载体将目的基因导人肝癌细胞供给了前提。有资料显示：用野生型p53腺病毒载体经肝动脉注射治疗转移性肝癌的临床试验，野生型p53基因导人肝癌细胞中，可以发挥杀灭或抑制肝癌细胞生长的作用，Terence等以受体介导基因转移系统介导野生型p53转染含突变p53的肝癌细胞株，觉察能明显抑制瘤细胞的生长，通过表达wtp53重组腺病毒载体，将p53基因导人肝癌细胞株一PLE/PRE/5细胞，通过诱导其凋亡和细胞周期阻滞可抑制癌细胞的生长。2023/10/3011举例方法：构建含人p53、B7-1、GM-CSF和IL-24种目的基因的重组腺病毒载体，感染3种肝细胞癌细胞系和肝细胞系L02，运用ELISA、免疫组化、流式细胞仪等方法，检测目的基因在肝癌细胞中的表达，和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果：肝癌细胞对腺病毒高度易感，腺病毒多重感剂量为50(50MOI)时，可使90%左右的肝细胞癌表达目的基因。除IL-2外，其他3个目的基因都能在肝癌细胞中高效表达。导入多基因后，肝癌细胞的生长受到确定程度的抑制，并诱导肝癌细胞发生凋亡；而L02肝细胞的生长却未受影响。结论：腺病毒载体是进展肝癌基因治疗的抱负载体，由一个腺病毒载体介导的多种目的基因，能在肝癌细胞系中高效表达，且能抑制肝癌细胞的生长和诱导其调亡。---------《腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响》中国普外根底与临床杂志2023年第6期第7卷

2023/10/3012非病毒法脂质体载体脂质体(liposome)是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡构造，每层均为类脂双分子膜，层间和脂质体内核为水相，双分子膜为油相。通过脂质体介导进展基因转移具有以下优势：①脂质体是非病毒性载体，转染过程便利易行，重现性好，与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质即被降解，无毒，无免疫原性；②DNA或RNA可得到疼惜，不被灭活或被核酸酶降解；③脂质体携带的基因可能转运至特定部位；④体外和体内试验都说明，接近染色体大小的DNA片段也能被转运至宿主基因组中并增长。运用脂质体作为载体较单纯导人基因具有更高的转染效率，在确定范围内，基因的量与转染效率成正比，同时宿主体不会消逝外源性病毒基因所致的特异性免疫反响，表达时间较腺病毒载体长、分裂期及非分裂期细胞均可被转染等特点。争论说明转铁蛋白能增加脂质体一基因转染。2023/10/3013举例方法：将载有人野生型p53-cDNA的真核表达质粒p53-pcDNA3，用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2，用流式细胞仪检测p53-pcDNA3对HepG2细胞生长的影响。结果：通过观看细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数觉察，HepG2细胞生长受到明显的抑制。结论：脂质体介导的p53基因可在HepG2细胞中表达，且明显抑制该细胞的生长。---------《脂质体介导的p53基因对肝癌细胞生长的抑制作用》免疫学杂志2023年第5期第16卷2023/10/3014PTD融合蛋白系统PTD融合蛋白系统(proteintransduetiondomain，PTD)是一个富含碱性氨基酸残基的蛋白构造域，PTD融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具。丁忠阳等成功构建了含p53基因的原核表达载体pTATHA／p53，在大肠杆菌BI21(DE3)Lyss内诱导表达并进展了纯化。通过纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB／c小鼠，制备高效价的抗血清，为应用PTD—p53基因治疗肝癌的试验争论奠定了理论根底。2023/10/3015举例方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分别野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTATHA和pET32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进展纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTD-p53融合蛋白参与HepG2细胞培育上清,利用间接免疫荧光法检测PTD-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53融合蛋白及p53蛋白,证明PTD-p53可以高效地转入HepG2细胞。结论：PTD-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTD-p53蛋白治疗肝癌的试验争论奠定了理论根底。--------《PTD-p53融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性》期刊荣誉：ASPT来源刊

CJFD收录刊2023/10/3016

存在的问题p53基因在治疗人类恶性肿瘤基因治疗中取得了确定的成绩，但仍存在很多缺乏之处。①缺乏高效的载体系统，目前被应用的载体都存在自身局限性，而且病毒本身也可导致相应的不良反响。②p53基因目的基因的持续表达。③降低p53基因在宿主体内的毒性和免疫原性是否会诱发原癌基因以及病人的安全性(如最小治疗剂量、最大毒性、耐受性及诱变性)等问题都有待进一步解决。2023/10/3017

展望p53基因是一种抱负的分子靶向肝癌治疗基因之一。通过人工转导修补突变的p53基