uplc-pda法同时测定香精香料中14种禁限用物质

uplc-pda法同时测定香精香料中14种禁限用物质

2011年，国家卫生部、农业部等部门根据风险监测和风险控制研究中遇到的问题，公布了151种食品和饲料中非法添加的物质清单，包括47种可以在食品中添加的非基本食品、22种“轻中规定食品”和82种“禁止在动物饲料、饮用水和家禽养殖过程中食用的药物和物质”。目前对于部分禁限用成分已有标准检测方法;有部分物质的分离分析方法已见报道,包括液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、离子色谱法等,但针对这些禁限用物质的检测方法还不全面,部分方法还存在检测效率较低、耗时长的缺点。苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、柠檬黄、日落黄、诱惑红、酸性红是151种非法添加物名单中的“易滥用食品添加剂”,GB2760-2011《食品添加剂使用标准》中对其有严格的限量要求;而酸性橙II、碱性嫩黄O则属于“违法添加的非食用物质”。香精香料为添加剂中一个重要的组成部分,为此本文结合超高效液相色谱(UPLC)分析速度快、分析灵敏度高的优点,通过梯度洗脱和可变波长扫描检测,建立了UPLC同时测定香精香料中的这14种禁限用物质的检测方法,方法操作简便、分析快速准确,可以很好地应用于香精香料实际样品的分析检测。1实验部分1.1超声纯化系统ACQUITY超高效液相色谱仪-光电二极管阵列(PDA)检测器(美国Waters公司);Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司);AE200分析天平(瑞士METTLER公司);SK5200型超声波振荡器(上海科导超声仪器有限公司);0.22μm有机针式过滤器(上海安谱科学仪器有限公司)。1.2对羟基苯甲酸甲酯methylparaben,etylparaben,fluka安赛蜜(acesulfamepotassium,纯度>99.9%)、糖精钠(saccharinsodium,纯度>99.9%),苯甲酸(benzoicacid,纯度>99.9%)、山梨酸(sorbicacid,纯度>99.9%)、对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben,纯度>99.9%)、对羟基苯甲酸乙酯(ethylparaben,纯度>99.9%)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben,纯度>99.9%)、对羟基苯甲酸丁酯(butylparaben,纯度>99.9%)均购自美国SUPELCO公司;日落黄(sunsetyellow,纯度>87%)、诱惑红(alluraredAC,纯度>80%)、酸性红(ponceau4RC,纯度>70%)、柠檬黄(tartrazine,纯度>99.9%)、酸性橙II(acidorangeII,纯度>99.9%)购自美国Fluka公司;碱性嫩黄O(auramineO,纯度>99.0%)购自上海安谱科学仪器有限公司。1.3试验条件1.3.1标准溶液的配制准确称取(精确到0.1mg)适量固体标准品于10mL容量瓶中,用甲醇(色谱纯)定容,分别配成1.0g/L的标准储备液,储存于4℃冰箱内,备用;吸取适量的标准储备液,用水定容分别配制混合标准溶液;如需要,用水继续稀释成所需要的系列混合标准溶液。1.3.2柱温和流动相色谱柱:ACQUITYUPLCTMBEHC18柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流速:0.2mL/min;柱温:35℃,进样量:5μL;检测波长扫描范围:200～500nm。流动相:A相为10mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)乙酸),B相为乙腈(色谱纯)。梯度洗脱程序:0.0～3.0min,5%B;3.0～8.0min,5%B～30%B;8.0～12.0min,30%B～70%B;12.0～12.5min,70%B～5%B。1.3.3超声材料的配制选取国内不同生产企业在用的10个香精香料样品作为考察样品,其中包括4种浸膏类样品、3种香精类样品、3种料液类样品。样品均质(固态样品需均质,液态样品可直接溶解):准确称取1g左右试样置于10mL容量瓶中,用水定容。如不能溶解,可加入适量的甲醇帮助溶解,室温下超声15min分散均质,均质溶液备用;如有固体颗粒,以5000r/min离心5min,取上层清液,备用。样品萃取:分别准确移取上述均质溶液或上层清液1mL置于10mL容量瓶中,依次加入1mL甲醇、1mL10%氨水水溶液及适量水,超声萃取15min,最后用水定容至10mL,摇匀,用0.22μm有机滤膜过滤萃取液,待测。2结果与讨论2.1色度条件优化2.1.1样品的制备及检测利用PDA检测器在200～500nm波长范围内对各组分的标准溶液进行全扫描,以各组分有最大吸光度的波长为定量波长对待测物质进行检测。其中柠檬黄的定量波长为426nm,安赛蜜为226nm,糖精钠为230nm,酸性红为332nm,日落黄为480nm,苯甲酸为225nm,诱惑红为314nm,山梨酸为259nm,酸性橙II为230nm,碱性嫩黄O为436nm,对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯均为255nm。紫外检测器为通用型检测器,色谱分离前段的检测物质较容易受到基质的影响。柠檬黄由于定量波长为426nm,具有专属性,本身可以排除很多低波段杂质的干扰;而糖精钠虽然处于230nm较容易受基质干扰的波长下,但由于其保留时间已经在2min左右,受到基质影响不大;安赛蜜由于比较靠近系统出峰时间,较易受到基质干扰,但通过全波段扫描后提取特定定量波长的过程,本身就具有排除干扰的功能,另外由于UPLC色谱柱分离柱效较高,分离度较好,基质和安赛蜜能得到较好的分离,同时还可以通过加标等辅助手段以确保定量的准确性。2.1.2流动相背景的影响液相色谱法的流动相中常用的有机相有甲醇和乙腈。由于甲醇本身的毒性低于乙腈,因此首先考虑使用甲醇。但以不同的淋洗梯度进行分离,强极性的几种小分子物质(如安赛蜜、糖精钠、苯甲酸等)均会同时出峰,且峰形不够尖锐,分离度不佳;另外根据PDA检测器扫描发现,糖精钠、酸性红等的最大吸收波长靠近200nm,而甲醇的紫外吸收波长(190nm)也在这个区域,由于流动相背景的增加和干扰,对目标物质的出峰和检测灵敏度会造成一定的影响。而以乙腈作为流动相的有机相时这种影响相对较小。因此本实验选择乙腈作为流动相的有机相。2.1.3乙酸缓冲液ph值对反应的影响对于所检测的禁限用物质,文献报道较为常用的是乙酸铵缓冲溶液作为流动相。乙酸铵缓冲溶液中酸的添加与否对于目标物质的分离有重要的影响,且乙酸的添加对于苯甲酸以及山梨酸的出峰峰形有很好的促进作用,实验发现如果不添加乙酸调节乙酸铵缓冲液的pH值,安赛蜜、糖精钠以及苯甲酸等物质全部都集中在2min以内出峰。为了考察酸的添加量对于目标物质分离的影响,考察了在流动相中添加体积分数为0.05%、0.1%、0.2%的乙酸后的分离效果,比较了乙酸添加量对于分离度和峰形的影响,发现添加0.1%乙酸时,各组分的分离和峰形最佳(见图1)。2.1.4流速对分析结果的影响分别考察了流速0.1、0.2、0.3mL/min对分离分析的影响,结果见图2。可以发现:流速越高,目标物质的出峰时间越快,峰形也越尖锐;在0.3mL/min的流速下,苯甲酸提前出峰,与酸性红同时出峰,影响分离。而流速越慢,则出峰时间明显拖后,峰展宽明显,分析时间加长,在0.1mL/min的流速下,整个分析时间大于13.0min,不利于快速分析的开展。在各组分同时提前或者延后的情况下,保留较弱的极性物质受到流速的影响尤为明显;当流速为0.2mL/min时,各个目标组分能较好地分离,且分析时间较短,因此选择最佳流速为0.2mL/min。2.1.5柱温对苯甲酸分离度的影响柱温对于高效液相色谱分析来说十分重要,既可以影响出峰时间,也会影响峰形。考察了30、35、40℃柱温对于目标物质的分离情况,结果发现,温度升高,各组分出峰时间均有不同程度的提前,且对出峰较早的几种物质影响更为明显;当柱温为30℃时,苯甲酸出峰稍迟,导致与诱惑红的分离度变小;而柱温为40℃时,苯甲酸出峰变快,与日落黄的分离度变小。综合考虑各个目标组分的分离度和出峰情况,最终选择柱温为35℃。2.2样品预处理方法的优化2.2.1萃取效率的提高针对目标物的前处理方法的报道有很多,采用的方法有直接溶液萃取法,也有固相萃取法。本实验测定的目标物大部分可以直接溶于水,因此直接用水进行萃取是一个较为简便和低成本的方法。但是如果直接用水萃取,对羟基苯甲酸酯类防腐剂的回收率并不理想,对羟基苯甲酸丁酯的回收率更是在50%以下,因此实验中考虑添加有机相(甲醇、乙腈)来提高该类物质的回收率,甲醇由于其低毒和廉价成为首选。本实验分别考察了添加体积分数为5%、10%、20%、30%、50%的甲醇对于目标物萃取效率的影响。结果发现,随着甲醇添加量的提高,对羟基苯甲酸类检测物质的回收率稍微有提高,但甲醇添加量若超过10%,对羟基苯甲酸丁酯的回收率又有明显的下降;甲醇添加量对于苯甲酸、山梨酸等没有明显的影响;但是安赛蜜和糖精钠的回收率在添加了超过10%甲醇后受到较大的干扰,在添加20%及以上甲醇的实验中,发现两个物质基本不出峰,回收率有明显的下降,这有可能是由于添加了有机溶剂后,有更多的基质被萃取,1min以前的杂质峰明显变大变杂,从而影响目标物的出峰和分离,而且安赛蜜和糖精钠是水溶性甜味剂,有机溶剂的添加不利于萃取的进行。综合考虑,最终选择10%甲醇为最佳有机溶剂添加量。2.2.2氨的含量对提取效率的影响实验发现,如果单独采用甲醇和水对目标物进行萃取,色素类目标物的回收率都不是很理想,甚至有不出峰的现象;这可能是由于所检测的色素类物质多为苯磺酸盐类化合物,其在没有一定电离度的条件下不能得到很好的萃取,因此本实验考虑向萃取溶液中添加一定量的氨水溶液,以促进色素类物质的电离,达到提高萃取效率的目的。实验中考察了添加体积分数为0.5%、1%、2%、3%的氨水对提取效率的影响,发现随着氨水含量的增加,色素类物质的响应有明显的提高,而安赛蜜和糖精钠的回收率则没有明显的变化,但如果氨水含量过高,则会由于影响苯甲酸的电离而造成苯甲酸不出峰或者与诱惑红同时出峰的结果。综合考虑各个检测组分的提取效果,最后选择添加1%氨水对样品进行萃取。2.3线性范围与比对在优化的色谱条件下对所配制的系列浓度的混合标准溶液进行测定,得到的色谱图见图3。以目标物的色谱峰面积y对其质量浓度x(mg/L)进行线性回归。从表1中可以看出,14种目标物在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数基本大于0.999(除了碱性嫩黄O为0.9950,对羟基苯甲酸丁酯为0.9961外)。在不含目标物的空白样品中添加标准样品,按照1.3.3节方法对样品进行处理后再进行测定,调整适合的浓度,以所检测物质的信号强度为基线噪声信号强度的3倍时的含量为该检测物质的检出限,得到所检测物质的检出限为0.32～2.51mg/kg(见表1)。2.4加标回收率和精密度在一典型料液空白样品中添加质量浓度为5、10和20mg/L的混合标准溶液,每个添加水平平行测定5次,进行加标回收率和精密度的测定,所得到的平均加标回收率和相对标准偏差(RSD)见表2。2.5禁限用物质测定结果选取国内不同生产企业在用的10个香精香料样品作为考察样品,采用本实验建立的方法进行处理与测定,结果发现,色素类和甜味剂类禁限用物质均未检出;有3个样品检出苯甲酸,其含量分别为150、160、100mg/kg;检出山梨酸的